BAA

ОБ УТВЕРЖДЕНИИ ИНСТРУКЦИИ О ПОРЯДКЕ
ПРОВЕДЕНИЯ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЙ КАРАНТИННОЙ
ЭКСПЕРТИЗЫ РАСТИТЕЛЬНЫХ МАТЕРИАЛОВ И ПОЧВЫ В
ПРИДНЕСТРОВСКОЙ МОЛДАВСКОЙ РЕСПУБЛИКЕ

ПРИКАЗ

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОЙ ЗАЩИТЫ
ПРИДНЕСТРОВСКОЙ МОЛДАВСКОЙ РЕСПУБЛИКИ

10 июля 2008 г.
N 379

(САЗ 10-25)

В соответствии с Законом Приднестровской Молдавской Республики от 11 марта 2004 года N 395-3-III "О фитосанитарном карантине" (САЗ 04-11) с изменениями и дополнениями, внесенными законами Приднестровской Молдавской Республики от 29 ноября 2005 года N 676-ЗИД-III (САЗ 05-49), от 8 апреля 2009 года N 705-ЗИД-IV,(САЗ 09-15), Законом Приднестровской Молдавской Республики от 12 марта 2004 года N 396-З-III "О защите растений" (САЗ 04-11) с изменениями и дополнениями, внесенными законами Приднестровской Молдавской Республики от 24 ноября 2004 года N 500-ЗИ-III (САЗ 04-48), от 23 декабря 2005 года N 712-ЗИД-III (САЗ 05-52), и на основании Указа Президента Приднестровской Молдавской Республики от 3 апреля 2007 года N 256 "Об утверждении Положения, структуры и штатной численности Министерства здравоохранения и социальной защиты Приднестровской Молдавской Республики" (САЗ 07-15) c изменениями и дополнениями внесенными указами Президента Приднестровской Молдавской Республики от 18 сентября 2007 года N 612 (САЗ 07-39), от 12 января 2008 года N 25 (САЗ 08-1),от 21 мая 2008 года N 308 (САЗ 08-20), от 19 августа 2008 года N 524 (САЗ 08-33), от 30 сентября 2008 года N 636 (САЗ 08-39), от 4 февраля 2009 года N 70 (САЗ 09-6),от 15 июня 2009 года N 410 (САЗ 09-25),от 27 января 2010 года N 40 (САЗ 10-4), Приказом Министерства здравоохранения и социальной защиты Приднестровской Молдавской Республики от 10 ноября 2006 года N 481 "Об утверждении Положения о Государственной службе ветеринарного и фитосанитарного благополучия Министерства здравоохранения и социальной защиты Приднестровской Молдавской Республики" (Регистрационный N 3785 от 19 января 2007 года) (САЗ 07-4), приказываю:

1. Утвердить Инструкцию о порядке проведения бактериологической карантинной экспертизы растительных материалов и почвы в Приднестровской Молдавской Республике (Приложение).

2. Направить настоящий приказ в Министерство юстиции Приднестровской Молдавской Республики для опубликования в шестом разделе Собрании актов законодательства Приднестровской Молдавской Республики

3. Контроль за исполнением настоящего Приказа возложить на начальника Государственной службы ветеринарного и фитосанитарного благополучия Министерства здравоохранения и социальной защиты Приднестровской Молдавской Республики Ткаченко В. Д.

4. Настоящий Приказ вступает в силу со дня официального опубликования.

г. Тирасполь

10 июля 2008 г.

    N 379

Приложение
к приказу Министерства
здравоохранения и социальной защиты
Приднестровской Молдавской Республики
от 10 июля 2008 года N 379

Инструкция о порядке проведения
бактериологической карантинной экспертизы
растительных материалов и почвы
в Приднестровской Молдавской Республике

                         1. Общие положения

1. Бактериологический анализ пораженных растительных тканей состоит практически из двух частей: первая - выделение бактерий, возбудителей болезней, из пораженной ткани больного растения в чистую культуру; вторая - определение морфологических и культуральных или физиологических свойств выделенных бактерий. Если свойства выделенного возбудителя болезни совпадают со свойствами, описанными для него в определителях, то на этом определение болезни может считаться законченным для бактериозов, хорошо изученных и описанных в литературе. В случаях, когда надо определить болезни, мало или совершенно ранее не изученные, следует прежде всего установить патогенность бактерий для тех растений, из которых они выделены, т. е. доказать, что выделенные микроорганизмы являются возбудителями наблюдаемого заболевания, после чего изучают свойства возбудителя.

2. Патогенность и вирулентность фитопатогенных бактерий устанавливаются опытами искусственного заражения. Опыты эти можно проводить в лаборатории или теплице, но не в открытом грунте, чтобы избежать распространения инфекции. Проверка патогенности бывает необходима иногда и при определении хорошо изученных бактериозов, например, в тех случаях, когда свойства изолированных бактерий несколько отличаются от описанных в литературе или когда хорошо изученные заболевания за рубежом впервые обнаружены на территории СНГ.

2. Экспертиза семян и растений кукурузы

3. Анализ семян кукурузы на выявление возбудителя бактериального увядания (вилта) - Bacterium stewarti E. F. Smith, 1914:

а) щуплые и сморщенные зерна кукурузы, пораженные возбудителем увядания, как правило, бывают расположены в нижней части початка. Их легко отличить от здоровых семян и отобрать для проведения бактериологического анализа;

б) если семена кукурузы поступают без початков (россыпью), то отбор следует производить, как и при фитопатологической экспертизе семян, при помощи бинокулярной лобной лупы. Для анализа берут семена щуплые, сморщенные, но с ненарушенной кожицей. Отобранные семена кукурузы подвергают длительному бактериологическому анализу, т. е. высевают на мясо - пептонный агар (МПА) в чашках Петри способом, описанным в разделе "Техника бактериологического лабораторного анализа";

в) после посева на МПА в термостате при 28°С выросшие на поверхности агара колонии рассматривают под лупой или лучше под микроскопом при малом увеличении. Если через 48 часов на МПА вырастают сначала палевые, а затем желтеющие колонии с ровным краем, иногда с кратерообразным углублением в центре, то из них производят выделение из одной колонии на косой агар нескольких одинаковых штаммов бактерий, морфологические и культуральные свойства которых определяются методом, также описанным в разделе "Техника бактериологического анализа". Если свойства выделенных штаммов совпадают с описанными ниже, определение возбудителя бактериального увядания кукурузы практически может считаться законченным.

  3. Морфологические и культуральные свойства Bacterium stewarti

4. Бактерии имеют вид неподвижных палочек величиной 0,5 - 0,7х1,0 - 2,0 микрона, образуют короткие цепочки и капсулы, грамотрицательны, аэробы. Колонии на агаре медленнорастущие, светло-желтые, мелкие, круглые, гладкие с ровным краем, иногда колонии имеют углубление в центре. На мясо-пептонном агаре (МПА) имеют слабый рост, беловатое колечко и желтый осадок. Желатин не разжижают, молоко не свертывают. Лакмусовое молоко розовеет. Нитраты не редуцируют, крахмал не гидролизуют, сероводорода и индола не образуют. Образуют кислоту, но не образуют газа на декстрозе, сахарозе, лактозе, а некоторые штаммы и на глицерине. Имеют хороший рост на среде Ушинского, слабый рост на среде Ферми, нет роста на среде Кона. Оптимальная температура роста 30°С, максимальная 39°С, бактерии погибают при 53°С.

4. Анализ живых растений кукурузы на выявление возбудителя
бактериального увядания

5. Вилт кукурузы, или сосудистый бактериоз, характеризуется образованием желтой слизи в сосудистой системе больного растения, потемнением узлов, карликовостью растении и усыханием листьев. На листьях появляются бледно - зеленые, постепенно темнеющие продольные полосы, переходящие при сильном поражении растения на стебель.

6. Пораженное растение выбрасывает метелки преждевременно и они имеют белый цвет. Погибшее от болезни растение остается частично зеленым, имея вид пораженного морозом. Желтая слизь, содержащая массу бактерий (их можно видеть под микроскопом), выступает каплями на поперечном срезе стебля. Из всех частей пораженного вилтом растения, имеющих признаки заболевания, можно делать посев на МПА так же, как и из семян для выделения и определения возбудителя болезни.

5. Экспертиза плодов и посадочного материала цитрусовых культур

7. Анализ на выявление рака цитрусовых, вызываемого Xanthomonas citri (Hasse) Dowson, 1939:

а) рак цитрусовых - весьма вредоносный бактериоз, вызывающий образование наростов на плодах, ветвях и листьях цитрусовых деревьев:

1) возбудитель болезни, проникая через устьица и ранения, распространяется в межклетных пространствах, вызывая гипертрофию тканей;

2) в результате деятельности бактерий на пораженном растении образуются весьма характерные наросты: небольшие, круглые с приподнятыми краями и кратерообразными углублениями в центре. На листьях вокруг наростов рака появляются светлые ореолы, и образующиеся таким образом пятна достигают 3 - 4 мм в диаметре. На плодах и ветках наросты не имеют светлых ореолов. На ветках восприимчивых сортов встречаются раковые образования до 15 см;

3) при столь характерном проявлении болезни ее во многих случаях можно диагностировать по внешнему виду. Однако иногда проявление рака цитрусовых маскируется другими микроорганизмами, которые поселяются на ткани наростов. Бывает, что наросты, сливаясь и разрастаясь (особенно на плодах), напоминают болезнь цитрусовых (цитрус - скэб), вызываемую грибным паразитом Sporotrichum citri;

б) есть и другие грибные заболевания, сходные по признакам повреждений с раком цитрусовых: Phomorsis citri, Phoma citricarpa, Colletotrichum gleosporioides;

в) во всех сомнительных случаях необходимо для точной диагностики рака цитрусовых проводить длительный бактериологический анализ с выделением возбудителя и определением его свойств.

    6. Морфологические и культуральные свойств Xanthomonas citri

8. Бактерии представляют собой палочки величиной 0,5 - 0,75х1,5 - 2,0 микрона. Они образуют цепочки и капсулы. Бактерии неспороносные, подвижные, имеют по одному полярному жгутику, грамотрицательны, аэробы. Колонии на МПА соломенно - желтые, блестящие, с дельными краями, вязкие, в отраженном свете матово - желтые, переходящие в голубоватые. Желатин разжижают, на МПБ образуют желтое кольцо; на картофеле - желтый блестящий налет, вначале окруженный узкой белой зоной, которая довольно быстро исчезает. Молоко свертывают, нитраты не редуцируют. Образуют аммиак, индол не образуют, крахмал гидролизуют. На средах Гиса с углеводами (декстроза, сахароза, лактоза, глицерин) ни кислоты, ни газа не образуют. Дают слабый рост на среде Ушинского. Оптимальная температура роста бактерий от 20° до 30°С, максимальная 35°С, бактерии погибают при 49 - 52°С.

         7. Анализ на выявление ожога цитрусовых, вызываемого
         Pseudomonas citriputeale (C. O. Smith) Stapp, 1923

9. Этот возбудитель также поражает плоды, ветви и листья цитрусовых, но не вызывает разрастания тканей. На поражаемых ожогом плодах образуются вдавленные темно - коричневые пятна, иногда даже черного цвета. Совершенно сходные пятна на кожице плодов цитрусовых могут образоваться при хранении или транспортировке. Сильные колебания температуры вызывают нарушение железок, и содержащиеся в них эфирные масла, ожигая кожицу плода, образуют такие же вдавленные пятна, но не инфекционного происхождения. Поэтому для выделения возбудителя ожога цитрусовых Pseudomonas citriputeale необходимо из ткани вдавленных пятен на плодах цитрусовых делать посевы на МПА. Рост колоний Pseudomonas citriputeale настолько характерен, что можно по их виду определить заболевание. Колонии - флуоресцирующие с волнистым краем

10. Из таких флуоресцирующих колоний легко выделить культуры бактерий на косой агар. Если нет времени или возможности определять свойства выделенных штаммов, то можно уточнить определение заболевания более быстрым способом - искусственным заражением плодов лимона, т. е. проверкой патогенности выделенных бактерий. Для этого берут здоровые лимоны с кожицей без пятен и повреждений, обтирают их спиртом. Наметив тушью место для заражения и написав на них номер штамма, которым заражают, делают несколько уколов иглой, смоченной разводкой бактерий. На место укола накладывают ватку, смоченную взвесью бактерий в стерильной воде. Для определения одного образца необходимо два лимона, так как один ставится как контроль: с уколами, но без инфекции. Контроль должен быть помещен в отдельную стеклянную посуду (большую чашку Коха или кристаллизатор с крышкой, или стеклянную банку с крышкой). Если проводится несколько определений одновременно, контроль можно ставить общий. Как правило, для всех опытов искусственного заражения контроль обрабатывается прежде, чем делается заражение бактериями. Уколы лимонов и контрольных и опытных надо делать тонкой энтомологической иглой и неглубоко на кожице, не проникая до мякоти плода, так как кислота, выступившая из мякоти плода, может препятствовать развитию внесенных при заражении бактерий.

11. Если испытываемые штаммы бактерий патогенны для цитрусовых и являются возбудителями ожога Pseudomonas citriputeale, то на зараженных лимонах через 4 - 5 дней при температуре 14°С должны образоваться темные вдавленные пятна.

12. При экспертизе посадочного материала или живых растений цитрусовых следует знать, что ожог от Pseudomonas citriputeale на коре ветвей образует довольно большие красно-коричневые пятна у черенков листьев или вокруг шипов. Эти пятна имеют вид как бы лакированных. Они резко отграничены от здоровой ткани. Пораженные листья чернеют начиная с черенков и опадают. Если необходимо точно выявить возбудителя, то проводят бактериологический анализ. Для посева на МПА следует материал срезать с пораженной коры ветвей на границе со здоровой тканью. Вид колоний на МПА должен быть, как и при выделении Pseudomonas citriputeale из плодов. Выделив штаммы из одной колонии на косой агар, определяют их свойства.

8. Морфологические и культуральные свойства Pseudomonas citriputeale

13. Бактерии имеют вид подвижных с одним полярным жгутиком палочек размером 0,6х1,2 - 1,8 микрона. Встречаются одиночные бактерии, парами или короткими цепочками. Спор и капсул не образуют. Грамотрицательны, аэробы. Колонии на агаре круглые с волнистыми краями и волнистой поверхностью, прозрачные, бесцветные, голубоватые в проходящем свете. При большом количестве бактерий колонии бывают с почти ровным краем, но с волнистой поверхностью. На МПБ образуют муть со слабой флуоресценцией. Молоко сначала слегка свертывают, затем пептонизируют. Лакмусовое молоко синеет. Желатин разжижают. На средах Гиса образуют кислоту без выделения газа на декстрозе, сахарозе, глицерине, но не на лактозе. Нитраты не редуцируют. Имеют слабую диастатическую активность. Образуют аммиак; сероводорода и индола не образуют, хорошо растут на средах Ущинского и Ферми, слабо на среде Кона. Оптимальная температура роста бактерий 28°С, максимальная 35°С, погибают при 51°С. Pseudomonas citriputeale принадлежит к флуоресцирующей группе фитопатогенных бактерий и является полиморфной формой. У разных штаммов имеются различные и мелкие отклонения в биохимических свойствах. Некоторые штаммы свертывают молоко, а некоторые пептонизируют его без предварительного свертывания. Сильно варьируют Pseudomonas citriputeale в образовании кислот на средах Гиса. По данным отечественной литературы, некоторые штаммы образуют кислоту только на глюкозе, другие только на сахарозе, но никогда не наблюдается образования кислот на лактозе.

14. Все среды, содержащие лактозу (лакмусовое молоко, среда Гиса с лактозой), всегда делаются щелочными. Подщелачивание среды происходит от усвоения бактериями углеродной цепи аминокислот, в результате чего выделяются аммиак и амины.

9. Экспертиза посадочного материала и укорененных растений маслин
на выявление возбудителя туберкулеза- Pseudomonas savastanoi
(E. F. Smith) Stevens, 1913

15. Наросты туберкулеза маслин образуются главным образом на ветвях, но бывают и на листьях и на корнях. Название болезни произошло от латинского слова бугорок tuberculum.

16. Заболевание начинает проявляться с образования на маслинах небольших бугорков, которые, разрастаясь, могут достигать величины грецкого ореха. Наросты туберкулеза имеют шероховатую поверхность и округлую форму, они похожи по внешнему виду на наросты корневого рака Bacterium tumefaciens E. F. Smith., C. O. Towhsend, 1907, особенно в тех случаях, когда расположены на корнях или около корневой шейки. Однако внутреннее строение этих образований совершенно различно.

17. Наросты корневого рака плодовых имеют плотную структуру внутренних тканей, а наросты туберкулеза маслин имеют внутри лабиринтообразные полости, наполненные слизью, содержащей бактерии - возбудители болезни. Полости эти хорошо видны на разрезе нароста. Бактерии - паразиты способны из полостей внутри первичного нароста проникать по древесине через спиральные сосуды в еще не зараженные части дерева и образовывать так называемые вторичные наросты, т. е. наросты, возникающие на пути продвижения инфекции внутри зараженного растения.

18. Для диагностики Pseudomonas savastanoi следует выделять культуру бактерий и определять их свойства. Посев на МПА лучше всего делать из внутренних тканей наростов, предварительно дезинфицируя наросты с поверхности, смачивая спиртом и обжигая в пламени горелки. Поверхностные слои нароста после обжигания срезают стерильным скальпелем, а для посева на МПА вырезают небольшой кусочек внутренней, более мягкой ткани.

19. Чашки Петри с МПА и выросшими колониями ставят на черную бумагу. Колонии Pseudomonas savastanoi белого цвета, поэтому хорошо видны на темном фоне.

10. Морфологические и культуральные свойства Pseudomonas savastanoi

20. Бактерии представляют собой палочки размером 0,4 - 0,8х1,2 - 3 микрона; располагаются парами или короткими цепочками; подвижные, имеют от 1 до 4 полярных жгутиков; 1грамотрицательны, аэробы. Колонии на МПА белые, гладкие, блестящие с ровными краями; на МПЖ колонии морщинистые с волнистыми краями.

21. МПБ на второй день мутнеет и образуется белая не сплошная пленочка. На картофеле бактерии образуют коричневый пигмент; желатин не разжижают; молоко не свертывают, но пептонизируют; нитраты не редуцируют; крахмал гидролизуют. На средах Гиса образуют кислоту, но не образуют газа с сахарозой и декстрозой. Индол образуют слабо; сероводорода не образуют; растут на средах Ушинского, Кона и Ферми. Оптимальная температура роста бактерий 23 - 25°С, максимальная 35°С, бактерии погибают при 43 - 45°С.

22. При определении свойств Pseudomonas savastanoi следует, кроме обычных посевов, во-первых, делать рассев выделенных бактерий на поверхность МПЖ в чашки Петри, так как они на МПЖ образуют характерного вида колонии; во - вторых, посев на картофель, чтобы проверить образование коричневого пигмента.

11. Экспертиза посадочного материала плодовых (семечковых и
косточковых) на выявление ожога, вызываемого Erwinia amilovora
(Burrill) Com. S. A. B., 1932

23. Ожог плодовых деревьев проявляется в явной и активной форме весной во время цветения. Цветы, соцветия, молодые побеги и листья сначала делаются как бы налитыми водой, а потом чернеют и отмирают, но не опадают, а остаются на деревьях. Пораженные ожогом деревья имеют вид опаленных пожаром. Весной из пораженных частей растения обильно выступает эксудат в виде капель жидкости, содержащей массу бактерий. С наступлением летней, более теплой и сухой погоды выделение эксудата прекращается, но почерневшие от ожога цветы и листья остаются на деревьях в течение всей вегетации и их можно видеть одновременно с уже образовавшимися плодами.

24. Незрелые плоды яблонь и груш также поражаются ожогом: они чернеют и тоже, не опадая, остаются на ветвях. Зрелые плоды уже не заражаются бактериями даже при искусственном заражении. Очень сходное проявление заболевания плодовых происходит при поражении их бактериями из группы флуоресцирующих Pseudomonas syringae, Ps. cerasi, но при этом никогда не наблюдается выделения эксудата весной. В остальное время года бывает трудно различить эти два бактериоза, поэтому для выявления карантинного ожога плодовых от Erwinia amilovora необходимо проводить выделение возбудителя и определение его свойств.

25. Возбудитель болезни Erwinia amilovora зимует в коре пораженных деревьев. Весной пораженные участки коры набухают и из них также выступают капли жидкого эксудата, содержащего бактерии, которые можно видеть под микроскопом в висячей капле или в окрашенном мазке (приемы эти описаны в главе "Техника бактериологического лабораторного анализа").

26. Пораженные участки коры заметно отличаются от здоровой ткани: кора подсыхает, морщится и опадает. Материал для посева на МПА при выделении возбудителя болезни следует брать на границе между здоровой и пораженной тканью. Колонии Erwinia amilovora мелкие, белого цвета, поэтому их хорошо видно на темном фоне. Рост колоний на МПА в чашках Петри удобно рассматривать на черной бумаге.

  12. Морфологические и культуральные свойства Erwinia amilovora

27. Бактерии - подвижные палочки с перитрихиальными жгутиками размером 0,7 - 1,0 х 0,9 - 1,8 микрона. Располагаются одиночно, парами или короткими цепочками. Спор и капсул не образуют. Грамотрицательные. Аэробы или факультативные анаэробы. Колонии на МПА мелкие, белые, опалесцирующие, круглые, блестящие, маслянистые, с ровными краями. На МПБ образуют сильное помутнение с легкой пленочкой. Желатин разжижают, молоко свертывают и пептонизируют. Нитраты не редуцируют. Индола, аммиака и сероводорода не образуют. Крахмал не гидролизуют. На средах Гиса с декстрозой, сахарозой, лактозой и глицерином образуют кислоту, но без выделения газа. Нет роста на среде Кона, некоторые штаммы способны слабо расти на среде Ушинского. Оптимальная температура 30°С, минимальная около 3°С, погибают при 45 - 50°С.

28. Биохимические свойства Erwinia amilovora весьма постоянны, более изменчива их вирулентность.

13. Экспертиза плодов и растений томатов на выявлени возбудителя
бактериального рака - Corynebacterium michiganense (E.F. Smith)
Jencen., 1934

29. Плоды томатов поражаются бактериальным раком как с поверхности, так и изнутри. Бактерии - возбудители болезни, попадая на поверхность плодов, образуют мелкие, круглые, темные пятна, окруженные светлым ореолом ("птичий глаз"). Пятна настолько характерны, что определение болезни возможно по внешнему виду. Внутреннее заражение плодов возникает в тех случаях, когда бактерии - паразиты проникают по сосудистой системе больного растения во внутренние ткани плодов. При сильном внутреннем поражении плоды деформируются и опадают незрелыми, но пятна "птичий глаз" на них не образуются. На разрезе плодов с внутренней инфекцией можно видеть пожелтевшие тяжи пораженных бактериями сосудов. Потемнение внутренних тканей плодов томатов не служит диагностическим признаком бактериального рака, потому что такое явление может возникнуть и от многих других причин. Определение возбудителя Corynebacterium michiganense во внутренних тканях плодов томатов проводится окраской по Граму (метод изложен в описании морфологических и культуральных свойств).

30. Бактериальный рак томатов (БРТ) - сосудистый бактериоз. Проникая в сосудистую систему пораженного растения, бактерии - возбудители болезни, размножаясь, вызывают закупорку сосудов, что ведет к увяданию и гибели всего растения. БРТ - заболевание, обычно медленно протекающее, увядает пораженное растение не сразу: вначале теряют тургор отдельные ветки, сосуды которых наполнены бактериями - так называемое одностороннее увядание. На стеблях больных растений образуются продольные трещины или язвы. На поперечных срезах стеблей видно, частично или полностью, потемневшее кольцо пораженных сосудов.

31. Потемнение сосудов в стеблях растений томатов могут вызвать и другие микроорганизмы, поражающие томаты: грибного и бактериального происхождения. Из этого видно, что для определения БРТ следует проводить бактериологический анализ с выделением возбудителя и проверкой его свойств.

             14. Морфологические и культуральные свойства
                    Corynebacterium michiganense

32. Бактерии представляют собой неподвижные короткие палочки величиной 0,35 - 0,4х0,8 - 1,0 микрон, спор не образуют,грамположительные, аэробы. На МПА колонии медленнорастущие, мелкие, круглые, выпуклые, с ровным краем, вначале белые,затем желтеющие. На картофеле рост хороший, колонии ярко - желтого цвета. На МПБ бактерии образуют медленное помутнение, через 3 - 4 дня появляется слабый слизистый осадок; образуют аммиак; сероводорода и индола не образуют. Желатин бактерии разжижают медленно, молоко медленно свертывают, некоторые штаммы молоко пептонизируют. Лакмусовое молоко обесцвечивают (восстанавливают лакмус), крахмал слабо гидролизуют, некоторые штаммы не имеют диастатической активности. Нитраты не редуцируют. На средах Гиса газа не образуют, кислоты образуют на декстрозе и сахарозе, слабее на лактозе и глицерине, одни штаммы образуют кислоты на одних углеводах, другие на других. Оптимальная температура роста 25 - 27°С, максимальная 33°С, погибают бактерии при 53°С. Бактерии очень устойчивы к высушиванию.

33. Практически выделение культуры Corynebacterium michiganense затрудняется тем, что бактерии очень медленно растут на МПА, особенно при первичных посевах из тканей растения. В этих случаях колонии вырастают на 6 - 7 день после посева.

34. Вообще же для диагностики всякого бактериального заболевания желательно иметь методы более быстрые, чем длительный бактериологический анализ, продолжающийся от 3 до 5 недель.

35. Для быстрого определения БРТ, профессор В. П. Израильский и 3. С. Артемьева разработали очень точный и скорый метод - метод окраски по Граму бактерий в тканях растений. Он был проверен при обследованиях посевов томатов для определения ареала распространения болезни и при контрольных обследованиях по оценке эффективности проводимых по борьбе с БРТ мероприятий и показал хорошие результаты.

15. Приготовление препаратов из ткани растения томата для окраски
по Грамму

36. Если получены или отобраны для лабораторного анализа свежие растения, то из поперечных или продольных срезов пораженных стеблей следует сделать на чистом предметном стекле отпечатки этих срезов. Если материал поступил на анализ уже подсушенным, то, сделав срезы стеблей, где видна пораженная ткань, делают соскоб этой ткани в каплю воды на предметном стекле и затем иглой распределяют растительный материал, смоченный водой на стекле равномерно. Более крупные и грубые кусочки ткани удаляют пинцетом.

37. Препараты, приготовленные указанным способом, подсушивают, а затем фиксируют, проводя их над пламенем горелки 3 - 5 раз. Окрашивают их по Граму так же, как препараты, изготовленные из чистых культур любых бактерий, свойства которых изучаются. Наиболее удобной для определения бактериального рака мы считаем окраску по Граму в модификации Саватеева.

16. Окраска по Граму готовых препаратов

38. На препарат наливают раствор генциан - или кристалл - виолета и выдерживают 1 - 1,5 минуты, затем краску сливают и на препарат наливают раствор Люголя, в котором препарат выдерживают тоже 1 - 1,5 минуты, после чего его отмывают спиртом (с йодом по Саватееву). Отмытый спиртом препарат дополнительно окрашивают раствором фуксина и сразу, не выдерживая в краске, хорошо промывают водой. Окраску генциан - виолетом можно производить при помощи бумажек, окрашенных раствором этой краски. Окрашенные по Граму препараты рассматривают при большом увеличении с иммерсией. В одном препарате просматривают от 20 до 40 полей зрения.

39. Раньше препарат после окраски генциан - виолетом и обработки раствором Люголя отмывали спиртом, но теперь в спирт добавляют йод, который окрашивает бактериальную клетку в постоянный, невымывающийся темно - лиловый цвет, если бактерия грамположительна.

40. Окраска бактерий по Граму основана на способности протоплазмы некоторых видов грамположительных бактерий образовывать с генциан - виолетом и йодом комплексное соединение темно - фиолетового цвета, неразрушающееся при обработке спиртом. Однако при слишком длительной обработке спиртом комплекс этот может быть разрушен и бактериальные клетки обесцвечены. Наличие в спирте йода, которым промывают препарат (по способу Саватеева), предохраняет это комплексное красящее вещество от разрушения и этим облегчает процесс отмывки спиртом окрашенного генциан - виолетом препарата.

41. Разработанный метод определения БРТ окраской бактерий в тканях растения по Граму основан на том, что других грамположительных фитопатологических бактерий во внутренних тканях томатов в сосудистой системе не встречается. Загнившие растения анализировать нельзя, так как среди гнилостных бактерий встречаются грамположительные. Этот метод применим также и для диагностики других грамположительных возбудителей бактериальных болезней растений: Corynebacterium insidiosum - возбудитель увядания и корневой гнили люцерны; Corynebacterium flaccumfaciens - возбудитель увядания фасоли; Corynebacterium sepedonicum - возбудитель кольцевой гнили картофеля.

17. Техника бактериологического лабораторного анализа (оборудование)

42. Для проведения бактериологического анализа необходимо иметь оптические приборы, аппаратуру, оборудование, мелкие инструменты и лабораторную посуду.

43. Микроскоп:

а) при работе с биологическим микроскопом марки МБИ-1 для изучения и измерения бактерий, кроме малых увеличений, чаще всего приходится прибегать к большим увеличениям с объективом 90 и к иммерсионной системе. Определение подвижности бактерий в висячей капле проводят с объективом 40. Для этого употребляют специальные предметные стекла с углублениями. Каплю с культурой бактерий в жидкой среде наносят на покровное стекло и затем, перевернув его так, чтобы капля оказалась в висячем положении, опускают на предметное стекло, следя за тем, чтобы капля свободно свисала над углублением. Рассматривая каплю под микроскопом, сначала находят край капли, а затем уже бактерии. Определение подвижности бактерий требует некоторого навыка, надо хорошо отличать самопроизвольное движение бактерий от броуновского, носящего беспорядочный пассивный характер. Подвижные бактерии оживленно движутся в поле зрения, изменяя направление, что хорошо видно, когда некоторые бактериальные клетки движутся от края капли. Если возникает сомнение в природе движения, то к культуре на МПБ прибавляют 5% карболовой кислоты или 0,1% сулемы. Если и после этого движение сохраняет прежний характер - значит оно броуновское;

б) с иммерсией просматривают сухие препараты с бактериями, окрашенными по Граму или другими способами, а также препараты, приготовленные из ткани растений томатов для определения их зараженности бактериальным раком. На такие препараты, находящиеся на предметном стекле, наносят каплю иммерсионного масла и рассматривают их при большом увеличении с объективом 90 и окуляром 15х, погрузив объектив в каплю масла. При такой системе препарат рассматривают без покровного стекла, поэтому делать наводку следует очень осторожно, чтобы не коснуться объективом предметного стекла;

в) измерения величины бактериальных клеток делают также с иммерсией. Определение цены деления окулярной линейки делают специально для иммерсионной системы. Каплю иммерсионного масла наносят на объективмикрометр и, опустив в нее объектив 90, делают совмещение окулярной и объективной линеек так же, как при малых увеличениях, и определяют величину деления окулярной линейки для данного увеличения. После работы с иммерсионным маслом объектив микроскопа следует протереть тряпочкой, смоченной химически чистым бензином.

44. Бинокулярный стереоскопический микроскоп МБС-1:

а) используется для просмотра более крупных объектов, чем бактериальные клетки, например, для просмотра колоний бактерий, вырастающих на МПА в чашках Петри. Такую чашку с агаром ставят крышкой вниз на столик микроскопа и рассматривают выросшие на МПА колонии в проходящем и отраженном свете. Цвет колоний и характер их роста являются важными диагностическими признаками;

б) выделение чистой культуры бактерий из одной колонии на косой агар тоже можно делать при помощи этого бинокуляра. Для данной операции чашку Петри открывают и ставят без крышки на столик микроскопа. Платиновую иглу, трижды прокаленную в пламени горелки, вводят между объективом и поверхностью агара и притрагиваются ею к намеченной для выделения колонии, контролируя эту операцию глазом через окуляр и объектив микроскопа. Взятый материал на кончике иглы вводят в пробирку с косым агаром и делают посев штрихом или волнистой линией.

45. Аппаратура для стерилизации посуды и сред, для выращивания

бактерий используется такая же, как описана для фитопатологического анализа, только режим стерилизации необходим более строгий, такой же, как в медицинской бактериологии.

46. Стерилизация паром при работе по бактериологии применяется для питательных сред и воды. В зависимости от стойкости среды применяют стерилизацию текучим паром или перегретым паром под давлением в автоклаве. Каждому показанию манометра, обозначающему величину давления пара, соответствует определенная температура:

Давление (атм.) Температура (градусы)

0,5 112,0

1,0 121,4

1,5 128,8

47. Перечень стеклянной и фарфоровой посуды, применяемый для фитопатологического анализа, следует дополнить фарфоровыми ступками, пипетками Пастера и шпателями Дрегальского.

                 18. Подготовка лабораторной посуды

48. Лабораторную посуду для выращивания бактерий и приготовления сред не моют хромовой смесью. Ее обезжиривают, тщательно отмывая мылом, содой, едким натрием или соляной кислотой. Насыщенным раствором двухромовокислого калия в крепкой серной кислоте обрабатывают только предметные стекла, которые после этого отмывают водой, а перед употреблением - спиртом.

49. Посуда, использованная для выращивания бактерий, перед мытьем обеззараживается кипячением с содой в течение часа или стерилизацией в автоклаве в течение часа текучим паром или 30 минут под давлением в 1 атмосферу.

50. Способы стерилизации в основном такие же, как и для работы по фитопатологии, их следует дополнить лишь характеристикой некоторых приемов, используемых в бактериологии.

51. Фарфоровые ступки с пестиками, требующиеся для растирания растительного материала перед посевом на МПА, стерилизуются смачиванием чистым 96%-ным спиртом: 1 - 2 мл спирта зажигают в ступке и горящим пламенем хорошо обжигают пестик и края ступки. Употреблять для этого денатурированный спирт не следует, потому что после выгорания денатурата в ступке могут остаться ядовитые вещества, способные задерживать или совсем останавливать рост бактерий. Стеклянные шпатели Дрегальского перед употреблением прокаливают в пламени горелки, а для охлаждения помещают их прокаленными согнутыми концами в стерильную чашку Петри, слегка приподняв с одной стороны крышку.

52. Мелкие металлические инструменты: ножницы, пинцеты, ланцеты - стерилизуют, опуская только в чистый спирт, но не в денатурат и обжигая в пламени горелки.

19. Приготовление питательных сред для выращивания бактерий

53. Материалы (агар - агар, желатин и др.), из которых приготовляются естественные и искусственные среды для грибов, в равной степени применяются и при изготовлении сред для выращивания бактерий. Среды для выращивания бактерий и рецепты приготовления их имеют свою специфику.

54. Основным отличием сред для бактерий от сред для грибов является их реакция. Среды для грибов должны иметь кислую реакцию, а среды для бактерий - нейтральную или слегка щелочную с рН 7,0 - 7,5. Некоторые среды используются как для грибов, так и для бактерий, например картофельно - глюкозный агар. Для выращивания на нем бактерий этот агар должен иметь рН 7,0 - 7,2, стерилизовать его надо текучим паром без давления три дня подряд или под давлением в 1 атмосферу 10 минут. Режим стерилизации сред для бактериологических работ должен быть строже, чем для фитопатологических.

55. При изготовлении сред для выращивания бактерий рН устанавливают упрощенным калориметрическим способом с универсальным индикатором - бромтимолбляу по цветной шкале, прилагаемой к нему. Бромтимолбляу указывает изменения рН в пределах от 6,0 до 7,6, изменяя цвет от желтого до синего. Реакцию среды проверяют, наливая в фарфоровую палетку несколько капель среды и индикатора; получающийся цвет сравнивают с цветной шкалой. Желтая окраска указывает на кислую реакцию среды, следовательно, среду надо нейтрализовать, добавляя немного соды до получения нужного рН, каждый раз сравнивая цвет среды с индикатором в палетках. Зеленовато - голубой цвет индикатора указывает, что рН 7,0.

56. Питательные среды по своему составу разделяются на белковые, содержащие белки или пептоны животного и растительного происхождения, и на безбелковые, или синтетические, в которых белковый или пептонный азот заменен минеральным азотом.

20. Рецепты питательных сред для выращивания бактерий

57. Белковые питательные среды:

а) мясо - пептонный бульон (МПБ). Для приготовления мясо - пептонного бульона берут 500 г мяса без сухожилий, без жира и костей, пропущенного через мясорубку, кладут в эмалированную посуду, заливают одним литром водопроводной воды и оставляют на 12 часов в холодном месте или на 4 - 6 часов в летнее время при комнатной температуре. Затем кипятят в течение 30 минут. Свернувшиеся белки отфильтровывают через холстину и второй раз пропускают через складчатый фильтр из фильтровальной бумаги. Фильтрат выливают в мерный литровый цилиндр и добавляют до одного литра дистиллированной или хорошо прокипяченной воды. На 1 литр полученного отвара прибавляют 10 г сухого пептона и 5 г чистой поваренной соли и подщелачивают содой до рН 7 - 7,2, затем осветляют МПБ белком так же, как МПА (см. ниже). После этого МПБ разливают по пробиркам или колбам и стерилизуют в автоклаве в течение 30 минут под давлением в одну атмосферу;

б) мясо - пептонный агар (МПА). Для приготовления мясо - пептонного агара на один литр мясо - пептонного бульона берут 15 г агар - агара и кипятят смесь до расплавления агара. Для осветления агара берут белок одного куриного яйца, тщательно отделенного от желтка, смешивают с двойным количеством воды и сбивают в пену. Полученную массу прибавляют к одному литру охлажденного до 50°С агара, хорошо размешивают и ставят в автоклав на 45 минут при давлении в пол - атмосферы. После этого агар фильтруют через вату, разливают по пробиркам или колбам и стерилизуют в течение 30 минут при давлении в 1 атмосферу. При возможности следует пользоваться сухим питательным агаром;

в) зеленый агар приготовляют путем прибавления к одному литру профильтрованного горячего МПА 1 мл краски малахитгрюн, после чего смесь тщательно перемешивают, разливают в колбы и стерилизуют так же, как и МПА. Раствор малахитгрюна для получения зеленого агара готовят следующим образом; 1,02 г малахитгрюна растирают в ступке, высыпают в колбочку, доливают 100 мл 96%-ного спирта и оставляют на сутки. По истечении суток раствор фильтруют. В склянке с притертой пробкой краска сохраняется длительный срок;

г) МПА с крахмалом. Для приготовления этой среды на 1 литр расплавленного горячего МПА добавляют 5 г растворимого крахмала, который предварительно размешивают в небольшом количестве холодной воды и выливают при помешивании в агар; после этого крахмальный агар разливают по пробиркам или колбам и стерилизуют в течение 30 минут при давлении в 1 атмосферу. Фильтровать агар после прибавления крахмала не следует;

д) МПБ с селитрой приготовляется путем добавки 2 г химически чистой селитры на 1 литр МПБ. После растворения селитры смесь разливают по пробиркам и стерилизуют в течение 30 минут при давлении в 1 атмосферу;

е) мясо - пептонный желатин(МПЖ). Для приготовления МПЖ берут МПБ с рН 7,5 и кипятят. Затем опускают в него лучший по качеству желатин в количестве 16%, снимают с огня, помешивают до полного растворения и вновь доводят рН до 7,5. После этого в остывшую до 40 - 50° жидкость прибавляют белок куриного яйца на 1 литр приготовленной среды, затем нагревают текучим паром в автоклаве до тех пор, пока осадок свернувшегося белка не опустится на дно. После этого желатин фильтруют через горячую воронку, разливают в стерильные пробирки и стерилизуют в течение 10 - 15 минут при температуре 112°. Для приготовления МПЖ в зимнее время желатина идет около 10-11 %. Продолжительное нагревание желатина понижает температуру его застывания. Желатин в пробирках, зараженный бактериями, в термостат не ставят, так как при температуре 28-30° он расплавляется. Такие посевы выдерживают при комнатной температуре зимой и в относительно прохладном помещении летом (при температуре приблизительно 18-22°С);

ж) все питательные среды, которые стерилизуются в течение непродолжительного времени (10 минут при температуре 112°), разливают в стерильные пробирки, чтобы избежать излишней споровой и другой микрофлоры. Для этой цели сухие пробирки закрывают ватными пробками и стерилизуют отдельно в сушильном шкафу так же, как и чашки Петри, при температуре 170° в течение одного часа или автоклаве при 120° с последующим высушиванием их в сушильном шкафу;

з) молоко простое обезжиренное (сепарированное) или снятое разливают в стерильные пробирки и стерилизуют в течение 10 минут при температуре 112°. После стерилизации молоко выдерживают трое суток в термостате при 28 - 30° для того, чтобы проросли споровые или другие устойчивые к нагреванию формы. Через три дня пробирки с молоком просматривают и те, в которых наблюдается прорастание, удаляют;

и) лакмусовое молоко приготовляется добавлением к 100 мл обезжиренного молока 5 мл лакмусовой настойки, после чего его подвергают стерилизации так же, как и простое молоко. Методика приготовления лакмуса заключается в следующем. 10 г сухого лакмуса мелко растирают в ступке, высыпают в колбочку и обливают десятикратным количеством 96%-ного спирта. Плотно закрывают колбу пробкой, тщательно смешивают встряхиванием и ставят в термостат при 37° на трое суток. Спирт ежедневно сливается с осадка декантацией и к осадку с лакмусом ежедневно прибавляется такое же количество чистого спирта. На третьи сутки спирт сливают вместе с осадком на фильтр, лакмус вместе с фильтром высушивают в термостате, после высушивания лакмус вновь растирают, заливают десятикратным количеством дистиллированной воды и держат в течение трех суток при комнатной температуре, периодически встряхивая. По истечении трех суток лакмусовую настойку фильтруют, разливают в стерильные пробирки по 5 мл и стерилизуют в течение 10 минут под давлением 0,5 атмосферы;

к) среды Гиса для определения сбраживания углеводов. Для получения сред Гиса необходимо прежде всего приготовить пептонную воду. Для этой цели на 1 литр дистиллированной воды прибавляют 10 г сухого пептона и 5 г поваренной соли. Доводя рН до 7,4 - 7,6, добавляют 1 % соответствующего углевода и около 1,0 - 1,25% лакмусовой настойки до получения слабо - синего цвета. Лакмусовую настойку можно заменить индикатором бромкрезолпурпур, окрашивать также до слабо - синего цвета (изменение цвета от индикатора идет в пределах рН 5,2 - 6,8 от желтого до пурпурно - фиолетового). Индикатор поступает в продажу расфасованным в маленьких пробирках с навеской в 0,1 г. Содержание пробирки растворяют в 20 мл теплого спирта и прибавляют воды до 100 мл. Приготовленные таким образом среды разливают в стерильные пробирки с поплавками для учета газообразования и стерилизуют в течение 10 минут при температуре 112°. После стерилизации пробирки со средами ставят на трое суток в термостат. По истечении этого срока просматривают каждую пробирку и уничтожают те пробирки, в которых изменилась окраска или получилось помутнение среды. Поплавки или обратные пробирочки можно изготовить из стеклянной трубочки 0,8 - 0,9 см в диаметре. Один конец такой пробирочки должен быть хорошо, запаян, в противном случае газ, образующийся в поплавке, может выходить через отверстие и тогда нельзя будет учесть его образование. При разливании сахаров в пробирки с поплавками последние всплывают, но после стерилизации в охлажденных пробирках поплавки должны быть полностью заполнены средой. Пробирку с имеющимся хотя бы очень маленьким пузырьком воздуха необходимо браковать, иначе могут получиться неправильные данные при читке пестрого ряда (цветные среды с углеводами).

21. Безбелковые или синтетические питательные среды

58. Синтетические среды содержат минеральные соли и минеральный азот в виде селитры, солей аммония, аминокислот или их солей. В качестве источников энергии в эти среды добавляют углеводы. Ниже мы указываем лишь те из синтетических сред, которые упоминаются во всех определителях фитопатогенных бактерий, чтобы дать представление об их составе. Состав этих сред несколько сложен и не всегда в лаборатории найдутся все компоненты для их приготовления. Практически при определении хорошо изученных возбудителей болезней выращивание определяемых бактерий на синтетических средах можно не производить. При определении и изучении новых видов фитопатогенных бактерий проверка их роста на трех ниженазванных синтетических средах обязательна.

59. Среда Кона: дистиллированной воды 1000 мл, виннокислого аммония 10 г, фосфорнокислого калия (одноосновная соль КН2РО4) 5 г, сернокислого магния 5 г, фосфорнокислого кальция (трехосновная соль Са3(РО4)2) 0,5 г.

60. Среда Ушинского: дистиллированной воды 1000 мл, глицерина 30 - 40 г, поваренной соли (химически чистой) 5 - 7 г, фосфорнокислого калия (двухосновная соль К2НРО4) 2,2 - 2,5 г, молочнокислого аммония 6 - 7 г, аспарагиновокислого натрия 3,4 г, хлористого кальция 0,1 г, сернокислого магния 0,2 - 0,4 г.

61. Среда Ферми: дистиллированной воды 1000 мл, виннокислого аммония 5 г, фосфорнокислого калия 5 г, сернокислого магния 5 г, фосфорнокислого кальция Са3(РО4)2 0,2 - 0,4 г.

22. Реактивы для определения бактерий и их свойств

62. Реактив Грисса. Для определения редукции нитратов бактериями необходим реактив Грисса, который состоит из двух, растворов:

а) раствор сульфаниловой кислоты: 0,5 г химически чистой сульфаниловой кислоты растворяют в 150 мл 29 - 30%-ной химически чистой уксусной кислоты;

б) раствор а - нафтиламина: 0,2 г а - нафтиламина нагревают в. 20 мл дистиллированной воды, не доводя до кипения. После этого процеживают через хлопчатобумажный фильтр в 150 мл 29 - 30%-ной уксусной кислоты. Перед самым употреблением смешивают в небольших, равных объемах оба раствора. Смесь растворов должна быть бесцветной.

63. Все вновь приготовленные реактивы и особенно реактив Грисса необходимо проверять. Для проверки реактива Грисса берут слабый раствор какой - нибудь соли азотистой кислоты, наливая 1 - 2 капли в фарфоровую чашечку, и затем приливают несколько капель реактива Грисса.

64. Появление ярко - розовой или красной окраски в чашечке свидетельствует о хорошем качестве реактива. Хранят растворы в склянках из томного стекла или обертывают обычные склянки черной бумагой.

65. Реактивы для окраски бактерий по Грамму:

а) раствор генциан - или кристалл - виолета: 100 мл спирта +5 мл глицерина +1 г метил - или генциан - виолета, все это смешать, оставить на ночь, на следующий день профильтровать;

б) люголевский раствор: 1 г йода +2 г йодистого калия растворить в 10 мл спирта, добавить соды до 300 мл;

в) спирт по Саватееву: 50 мл спирта +1 мл 9%-ной йодной настойки на спирту;

г) фуксин: 1г основного фуксина в 100 мл спирта несколько капель глицерина оставить на ночь, на следующий день профильтровать.

66. Для более удобного окрашивания препаратов употребляют бумажки, окрашенные генциан - виолетом. Фильтровальную бумагу нарезают прямоугольными кусочками, несколько меньшими предметных стекол, смачивают их готовым раствором генциан - виолета и раскладывают на стекле для просушки. Высушенные генциан - виолетовые бумажки используют при окраске по Граму. Наложив сухую окрашенную бумажку на препарат, смачивают ее водой и препарат подогревают на пламени горелки так же, как и при окраске его раствором генциан - виолета. Краска, содержащаяся в бумажке, при этом растворяется и окрашивает бактерии. Препараты, окрашенные таким способом, получаются более чистыми, свободными от лишней краски. Генциан - виолет сохраняется высушенным в бумажках долгое время, не портясь и не меняя концентрации.

23. Краски и индикаторы

67. Метиленовая синь. 20 г метиленовой сини растворяют в 300 мл 96%-ного спирта. Для окраски бактерий применяются спирто - водные растворы различной крепости: на 1 мл профильтрованного насыщенного спиртового раствора краски берут от 10 до 40 мл воды.

68. Щелочная синь Леффлера. К 100 мл соды прибавляют 30 мл профильтрованного насыщенного спиртового раствора метиленовой сини и 1 мл однопроцентного раствора едкого калия. Чем дольше стоит раствор, тем выше становится качество этой краски.

69. Фуксин. Насыщенный спиртовой раствор готовят путем растворения 30 г сухой краски в 200 мл 96%-ного спирта. Для окрашивания берут 10 - 20 мл профильтрованного насыщенного спиртового раствора, разбавленного 100 мл дистиллированной воды.

70. Фуксин по Цилю. 10 мл профильтрованного насыщенного спиртового раствора фуксина прибавляют к 100 мл 5%-ной карболовой кислоты. Эта краска употребляется для окраски спор. Для окраски бактерий ее разбавляют водой в 5 - 10 раз (фуксин Пфейфера).

71.Эритрозин. 2 - 3%-ный раствор эритрозина готовят в 5%-ной карболовой кислоте. Для окрашивания достаточно 5 - 10 минут. Необходимо следить, чтобы краска не высыхала. Окраска эритрозином после промывания водой получается особенно чистой, так как окрашиваются исключительно бактерии, а органические вещества отмываются водой. Эта краска особенно рекомендуется для бактерий, выросших на жидких питательных средах из растительных экстрактов или на синтетических средах. Если необходимо получить окраску синего или даже черного цвета, то после окраски эритрозином и промывания водой обрабатывают препарат метиленовой синью от 2 до 5 секунд и опять промывают водой. Такая окраска гораздо сильнее, чем окраска одной только метиленовой синью или одним эритрозином.

72. Бромкрезолпурпур- 0,1 г растворяют в 20 мл теплого - 86%-ного спирта и доводят водой до 100 мл.

73. Бромтимолбяу - 40 мг растворяют в 100 мл 86%-ного спирта.

74. Малахитгрюн - 1,02 г растирают в ступке и растворяют в 100 мл 86%-ного спирта. Раствор оставляют на сутки, затем фильтруют. Хранят в склянке с притертой пробкой.

            24. Методы выделения фитопатогенных бактерий

75. Подготовку лабораторной посуды и заливку питательных сред для выделения бактерий из зараженных бактериозом частей растений производят на столе, покрытом стеклом. На столе раскладывают стерильные чашки Петри, ступки, шпатели и др. МПА в склянках расплавляют на водяной бане, затем его охлаждают, доводя до температуры 46 - 50°, обжигают пробку и горлышко склянки, вынимают пробку и, осторожно приподняв левой рукой крышечку чашки Петри, вливают в нее из склянки питательную среду в таком количестве, чтобы дно чашки было ею покрыто. Таким же образом заполняют все чашки Петри. Выливать агар в чашки при высокой температуре не рекомендуется, чтобы избежать конденсации паров на крышках чашек.

25. Приготовление суспензии бактерий и техника посева

76. Фитопатогенные бактерии можно выделять из любой части растений, на которой имеются признаки, поражения (корень, стебель, семена и т. д.), причем желательно иметь свежий материал, так как многие виды бактерий из сухого, долго пролежавшего материала выделяются с большим трудом или совсем не выделяются. Дезинфицировать свежие части растения перед взятием их для посева в большинстве случаев не рекомендуется. Это относится к листьям и стеблям травянистых растений. Только плотные части растения (опухоли, одревесневшие чисти растения - стебли, семена, мясистые корни) можно дезинфицировать с поверхности.

77. Дезинфицируют материал в растворе сулемы 1:1000 1 - 3 минуты с последующим отмыванием сулемы спиртом и затем 3 - 4 раза стерильной водой или погружением в спирт и быстрым обжиганием в пламени горелки. Из исследуемого образца отбирают части с наиболее характерными внешними признаками поражения, затем заранее продезинфицированным в пламени и остуженным скальпелем или ножницами вырезают из разных мест небольшие частички пораженной ткани и растирают их пестиком в стерильной ступке с небольшим количеством стерильной воды до получения однообразной массы.

78. После этого прокаленной над пламенем горелки платиновой петлей или пестиком переносят небольшую часть полученной эмульсии на поверхность застывшего в чашке Петри питательного агара. Затем стерильным шпателем Дрегальского равномерно размазывают перенесенный материал по всей поверхности и этим же шпателем проводят по поверхности второй и третьей чашек. Таким путем производят разведение посевного материала на питательной среде.

79. Почти всегда в частях больного растения находится много посторонних бактерий. Поэтому для выделения фитопатологических бактерий, кроме посева на МПА, рекомендуют одновременно засевать такое же, а иногда и большее количество посевного материала на среду МПА с зеленой краской малахитгрюн. Таким образом, получается два параллельных посева с одним и тем же исходным материалом. Чашку с зеленым агаром необходимо отметить, так как при развитии микроорганизмов зеленый цвет иногда исчезает.

80. Краска малахитгрюн обладает способностью задерживать рост спорообразующей и грамположительной микрофлоры; последнее обстоятельство необходимо учесть при выделении грамположительных фитопатогенных бактерий Corynebacterium michiganense, Corynebacterium sepedonicum и при выделении их не применять агар с малахитовой зеленью. После посева шпатель опускают в дезинфицирующую жидкость или в водяную баню и кипятят вместе со ступкой и пестиком. Чашки с посевом дном вверх ставят в термостат при температуре 28 - 30°. Перевертывают чашки для того, чтобы избежать конденсации паров воды в виде капель на крышке чашки.

26. Выделение чистых культур бактерий под микроскопом

81. Через несколько дней (2 - 4) чашки Петри, в которых сделан посев, вынимают из термостата, просматривают сначала невооруженым глазом, а затем, не открывая чашки, знакомятся с формой колоний под лупой. После этого закрытую чашку Петри ставят дном вверх на столик микроскопа и рассматривают формы колоний при малом увеличении с укороченным объективом или в стереоскопический бинокулярный микроскоп МБС-1.

82. Колонии бактерий, которые подлежат дальнейшему детальному изучению, отмечают восковым карандашом, после чего приступают к выделению культуры бактерий из одной колонии на косой агар в пробирках. В некоторых случаях вид и характер роста колоний на агаре могут быть достаточным признаком для определения болезни, например, при определении некроза цитрусовых, вызываемого Pseudomonas citriputeale.

83. На косой агар выделяют 4 - 6 штаммов из колонии, по цвету и характеру роста соответствующих описанию в определителях для данного возбудителя. Выделенные из одной колонии штаммы ставят в термостат при температуре 28 - 30°С на 2 - 3 дня, ежедневно просматривая рост на косом агаре. Если рост однородный и по виду сходен с предполагаемым возбудителем заболевания, то приступают к определению свойств изолированной культуры.

27. Определение морфологических и культуральных свойств бактерий

84. Современная диагностика фитопатогенных бактерий основана на определении их морфологических и культуральных, или биохимических, свойств.

85. К морфологическим свойствам относится строение колонии на твердых средах (МПА и МПЖ). Выросшие на плотных средах колонии, принадлежащие к различным видам, разнообразны но своему внешнему виду, окраске, внутреннему строению, окаймлению, профилю, констистенции и пр. Различны величина и форма отдельных бактериальных клеток, расположение жгутиков, если они имеются, способность образовывать споры и капсулы, подвижность бактерий и отношение к окраске по Граму. При выращивании на МПБ, кроме подвижности, определяется и скорость роста - помутнение, образование осадка и пленки, аммиака и сероводорода.

86. Культуральные свойства характеризуют, главным, образом, функции ферментативного аппарата. Способность разжижать желатин указывает на наличие протеолитических (разлагающих белки) ферментов. Характер разжижения при посеве уколом в пробирку - в форме воронки, чашечки и пр. также является диагностическим признаком.

87. Рост бактерий на молоке может вызывать свертывание молока, происходящее от кислотообразования либо от образования сычужного фермента. Рост культуры на молоке с лакмусом показывает, идет ли образование кислоты или среда становится щелочной.

88. Способность бактерий восстанавливать нитраты в нитриты определяется при выращивании их на МПБ с добавлением селитры.

89. Кроме действия бактерий на вышеперечисленные азотные вещества, определяется их действие на углеводы. Практически достаточно бывает исследовать четыре компонента - Глюкозу (декстрозу), сахарозу, лактозу и глицерин.

90. Диастатическую активность бактерий, способность их к гидролизу крахмала определяют, выращивая их на МПА с крахмалом в чашках Петри и последующей пробой на крахмал йодом.

91. Определение всех вышеуказанных свойств бактерий - возбудителей болезней проводится последовательно, а результаты записываются в таблице (см. таблицу N 1).

92. Прежде всего наблюдают и отмечают цвет и вид колоний на МПА. Затем из этих колоний выделяют несколько штаммов на косой агар. Когда изолированные бактерии хорошо вырастут, все штаммы высевают одновременно на все среды, необходимые для их определения, и делают препараты для окраски по Граму. Препараты для окраски всегда следует делать из молодых разводок. Измерения величины бактериальных клеток можно делать на препаратах, окрашенных по Граму.

93. Все пробирки с посевами на твердых и жидких средах для каждого штамма закрепляют резиновым обхватом и ставят в термостат при температуре 28 - 30°С. Туда же ставят чашки Петри с посевом на МПА с крахмалом.

94. В пробирки с МПЖ делают посев бактерий уколом и выращивают их при комнатной температуре.

95. Наблюдения за изменениями в процессе роста бактерий на средах производят систематически с первого дня после посева. В течение первых трех дней через 24 часа, 48 часов и 72 часа определяют подвижность бактерий в висячей капле, используя, культуры на МПБ. Если подвижность установлена в первый же день, то последующих наблюдений не требуется. Если же бактерии при первом определении неподвижны, то следует продолжить просмотр в висячей капле, потому что у некоторых бактерий способность к движению проявляется не сразу.

96. Параллельно с определением подвижности надо вести наблюдения и за ростом на средах Гиса и на молоке, вначале ежедневно, затем через 2 - 3 дня, а далее через 5 - 6 дней. Изменение реакции при росте бактерий на средах с углеводами иногда происходит медленно - через 3 - 4 недели. На седьмой день определяют нитриты на МПБ с селитрой и ставят пробу на гидролиз крахмала.

97. Восстановление нитратов определяют, внося несколько капель разводки на МПБ с селитрой в фарфоровую палетку и добавляя туда реактив Гриса. Ярко - розовая окраска указывает на присутствие нитритов. Пробу на крахмал делают с раствором Люголя, употребляемым для окраски по Граму, наливая его в агар пипеткой столько, чтобы покрыть всю поверхность его в чашке Петри. Если бактерии не образуют диастазу, то получается реакция крахмала с йодом - резкое посинение; если реакция ее получается, это значит бактерии гидролизовали крахмал в сахара. Иногда крахмал гидролизуется не полностью, и при пробе с йодом образуется розовая или пурпуровая окраска, а не синяя, например, при росте Pseudomonas savastanoi - возбудителя туберкулеза маслин.

98. В большинстве случаев указанных реакций бывает достаточно для определения фитопатогенных бактерий, но иногда необходимы дополнительные реакции, например, посевы на среды. Кона, Ушинского и Ферми, а также определение сероводорода, аммиака и индола.

99. Определение сероводорода. Для определения сероводорода засевают пробирку с МПБ, затем пропитывают насыщенным раствором уксусного свинца длинную полоску фильтровальной бумаги, зажимают ее между пробкой и краем пробирки так, чтобы конец не касался среды, и покрывают пробирку колпачком из резины или пергаментной бумагой. Присутствие сероводорода определяется почернением бумаги. Поэтому за почернением бумаги следят ежедневно, так как черная окраска может исчезнуть под влиянием окисления.

100. Определение аммиака. Для обнаружения аммиака, образуемого культурой бактерий, МПБ засевают исследуемым штаммом. Зажимают между пробкой и краем пробирки полоску влажной красной лакмусовой бумажки, свободно свешивающуюся в пробирку так, чтобы она не касалась среды, плотно закрывают пробирку резиновым колпачком или пергаментной бумагой. Посинение лакмусовой бумажки указывает на образование аммиака.

101. Определение индола (по Сальковскому). Недельную бульонную культуру бактерий нагревают с 4 мл 10%-ной серной кислоты, затем прибавляют 0,5 - 2 мл 0,05%-ного раствора азотистокислого натрия и продолжают нагревание. Если индол присутствует - появляется красно - фиолетовое окрашивание.

                28. Правила карантинной профилактики

102. Правила карантинной профилактики:

а) все работы по экспертизе и анализу импортных растительных материалов должны производиться в халатах. При выходе из помещения, где производились работы, халаты снимают. Столы, на которых проводят экспертизу и анализы, должны быть покрыты стеклом;

б) после каждой экспертизы подозрительных на заболевание, а также явно зараженных образцов стол, на котором проводилась работа, и все предметы, бывшие в употреблении, обеззараживают спиртом. Остаток растительного материала и упаковки тщательно удаляют со стола и сжигают;

в) импортную упаковку - бумагу, стружки, солому, мох и др. - обязательно заменяют отечественной. Импортную упаковку сжигают;

г) посуду, предметные, покровные и часовые стекла, центрифужные и химические пробирки, а также фарфоровые ступки, пестики и др., употребляемые при лабораторных анализах, можно использовать только при работе с одним образцом, после чего их кипятят два часа, а затем хорошо промывают в проточной воде. Сита после каждого просевания почвы тщательно очищают от почвы сухой марлей или мягкой тряпочкой, а затем обтирают спиртом или бензином, после чего так же, как и посуду, кипятят два часа, а затем промывают в проточной воде. Марлю и тряпочки после обтирания сита сжигают;

д) зараженную возбудителем рака картофеля почву после анализа рассыпают тонким слоем на железном противне, обливают керосином и сжигают;

е) все работы по анализу почвы при помощи органических жидкостей производят в вытяжном шкафу, поскольку их пары вредны для человека. При отсутствии вытяжного шкафа работу с органическими жидкостями можно вести лишь в хорошо проветриваемом помещении.

103. Контроль за выполнением настоящей Инструкции возлагается на Государственную службу ветеринарного и фитосанитарного благополучия и иные органы государственной власти в пределах компетенции, установленной действующим законодательством Приднестровской Молдавской Республики.

104. Ответственность за нарушение настоящей Инструкции устанавливается действующими нормативными правовыми актами Приднестровской Молдавской Республики.