BAA
О ВВЕДЕНИИ В ДЕЙСТВИЕ МУК МЗ И СЗ ПМР 4.2.801-11
"МЕТОДЫ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ
ПАРФЮМЕРНО-КОСМЕТИЧЕСКОЙ ПРОДУКЦИИ"
ПРИКАЗ
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОЙ ЗАЩИТЫ
ПРИДНЕСТРОВСКОЙ МОЛДАВСКОЙ РЕСПУБЛИКИ
16 декабря 2011 г.
N 656
(САЗ 12-7)
Согласован:
Государственная служба охраны труда
и промышленной безопасности,
Министерство промышленности В соответствии с Законом Приднестровской Молдавской от 3 июня 2008 года N 481-3-IV "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения" (САЗ 08-22), с изменением и дополнениями, внесенными Законом Приднестровской Молдавской Республики от 6 августа 2009 года N 838-ЗИД-IV (САЗ 09-32), в целях дальнейшего совершенствования санитарнопротивоэпидемического обеспечения населения Приднестровской Молдавской Республики, приказываю:
1. Ввести в действие МУК МЗ и СЗ ПМР 4.2.801-11 "Методы микробиологического контроля парфюмерно-косметической продукции" (Прилагается).
2. Считать утратившим силу подпункт "я-89" пункта 1 Приказа Министерства здравоохранения и социальной защиты Приднестровской Молдавской Республики от 10 февраля 2003 года N 129 "О введении в действие некоторых санитарно-эпидемиологических нормативных документов на территории Приднестровской Молдавской Республики" (регистрационный N 2067 от 24 марта 2003 года) (САЗ 03-13), с изменениями, внесенными приказами Министерства здравоохранения и социальной защиты Приднестровской Молдавской Республики от 24 сентября 2004 года N 520 (регистрационный N 2966 от 20 октября 2004 года) (САЗ 04-43), от 16 марта 2005 года N 125 (регистрационный N 3197 от 27 апреля 2005 года) (САЗ 05-18), от 15 августа 2006 года N 367 (регистрационный N 3708 от 9 октября 2006 года) (САЗ 06-42), от 22 ноября 2006 года N 503 (регистрационный N 3800 от 1 февраля 2007 года) (САЗ 07-6), от 29 декабря 2006 года N 576 (регистрационный N 3789 от 23 декабря 2007 года) (САЗ 07-5), от 15 января 2007 года N 14 (регистрационный N 3818 от 8 февраля 2007 года) (САЗ 07-7), от 16 января 2007 года N 19 (регистрационный N 3831 от 19 февраля 2007 года) (САЗ 07-9), от 23 января 2007 года N 39 (регистрационный N 3828 от 15 февраля 2007 года) (САЗ 07-8), от 23 января 2007 года N 40 (регистрационный N 3814 от 6 февраля 2007 года) (САЗ 07-7), от 28 февраля 2007 года N 128 (регистрационный N 3865 от 22 марта 2007 года) (САЗ 07-13), от 17 апреля 2007 года N 223 (регистрационный N 3938 от 28 мая 2007 года) (САЗ 07-23), от 26 апреля 2007 года N 246 (регистрационный N 3955 от 11 июня 2007 года) (САЗ 07-25), от 4 июня 2007 года N 326 (регистрационный N 3974 от 28 июня 2007 года) (САЗ 07-27), от 3 июля 2007 года N 384 (регистрационный N 4031 от 7 июля 2007 года) (САЗ 07-33), от 31 августа 2007 года N 486 (регистрационный N 4237 от 12 января 2008 года) (САЗ 08-1), от 6 ноября 2007 года N 609 (регистрационный N 4254 от 17 января 2008 года) (САЗ 08-2), от 6 ноября 2007 года N 611 (регистрационный N 4212 от 21 декабря 2007 года) (САЗ 07-52), от 23 ноября 2007 года N 675 (регистрационный N 4210 от 21 декабря 2007 года) (САЗ 07-52), от 18 декабря 2007 года N 748 (регистрационный N 4264 от 23 января 2008 года) (САЗ 08-3), от 30 марта 2009 года N 167 (регистрационный N 4810 от 23 апреля 2009 года) (САЗ 09-17), от 21 апреля 2009 года N 210 (регистрационный N 4840 от 18 мая 2009 года) (САЗ 09-21), от 19 июня 2009 года N 321 (регистрационный N 4904 от 9 июля 2009 года) (САЗ 09-28), от 27 октября 2009 года N 520 (регистрационный N 5069 от 27 ноября 2009 года) (САЗ 09-48), от 3 декабря 2009 года N 606 (регистрационный N 5139 от 2 февраля 2010 года) (САЗ 10-5), от 19 февраля 2010 года N 75 (регистрационный N 5203 от 16 апреля 2010 года) (САЗ 10-15), от 1 сентября 2010 года N 437 (регистрационный N 5399 от 30 сентября 2010 года) (САЗ 10-39), от 15 сентября 2010 года N 461 (регистрационный N 5415 от 13 октября 2010 года) (САЗ 10-41), от 24 июня 2010 года N 281 (регистрационный N 5440 от 12 ноября 2010 года) (САЗ 10-45), от 1 сентября 2010 года N 436 (регистрационный N 5433 от 5 ноября 2010 года) (САЗ 10-44), от 13 июня 2011 года N 316 (регистрационный N 5648 от 21 июня 2011 года) (САЗ 11-25), от 1 июля 2011 года N 355 (регистрационный N 5696 от 21 июля 2011 года) (САЗ 11-29), от 6 июля 2011 года N 365 (регистрационный N 5997 от 25 июля 2011 года) (САЗ 11-30), от 29 сентября 2011 года N 495 (регистрационный N 5779 от 29 октября 2011 года) (САЗ 11-43), от 4 октября 2011 года N 500 (регистрационный N 5775 от 24 октября 2011 года) (САЗ 11-43).
3. Контроль за исполнением настоящего Приказа возложить на Главного государственного санитарного врача Приднестровской Молдавской Республики Шинкарюк С.С.
4. Настоящий Приказ вступает в силу со дня официального опубликования.
И. ТКАЧЕНКО
МИНИСТР
г. Тирасполь
16 декабря 2011 г.
N 656
Приложение к Приказу Министра
здравоохранения и социальной защиты
Приднестровской Молдавской Республики
от 16 декабря 2011 г. N 656
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МУК МЗ и СЗ ПМР 4.2.801-11
"Методы микробиологического контроля
парфюмерно-косметической продукции"
Раздел 1. Общие положения и область применения
1. Настоящие методические указания (далее - МУ) разработаны в соответствии с Законом Приднестровской Молдавской Республики от 3 июня 2008 года N 481-3-IV "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения" (САЗ 08-22) с изменением и дополнениями, внесенными Законом Приднестровской Молдавской Республики от 6 августа 2009 года N 838-ЗИД-IV (САЗ 09-32), в целях дальнейшего совершенствования санитарно-эпидемиологического обеспечения населения Приднестровской Молдавской Республики.
2. Настоящие МУ предназначены для обеспечения контроля качества парфюмернокосметических изделий по микробиологическим показателям и устанавливают методы лабораторных испытаний качества парфюмерно-косметической продукции по микробиологическим показателям безопасности для здоровья человека, проводимых в порядке производственного контроля, государственного санитарно-эпидемиологического надзора и при испытании указанной продукции в целях сертификации соответствия.
3. Настоящие МУ предназначены для использования в аккредитованных бактериологических производственных, испытательных лабораториях и лабораторных организаций государственной санитарно-эпидемиологической службы Министерства здравоохранения и социальной защиты Приднестровской Молдавской Республики.
4. Данный документ разработан в связи с необходимостью унификации и усовершенствования методов микробиологического анализа парфюмерно-косметической продукции.
Методы адаптированы к условиям работы лабораторий, осуществляющих контроль качества и безопасности парфюмерно-косметической продукции.
5. Настоящие МУ должны учитываться при пересмотре действующей и разработке вновь создаваемой нормативной документации на парфюмерно-косметическую продукцию.
Раздел 2. Методы отбора и подготовки проб
для микробиологического анализа
Глава 1. Отбор проб
6. При отборе проб следует руководствоваться требованиями ГОСТ 29188.0-91 "Парфюмерно-косметические изделия. Правила приемки, отбор проб, методы органолептических испытаний" утвержденный Приказом Министерства Промышленности Приднестровской Молдавской Республики от 29 ноября 2002 года N 480 (регистрационный N 1897 от 6 декабря 2002 года) (САЗ 02-49) и ГОСТ 26668-85 "Продукты пищевые. Методы отбора проб для микробиологических анализов", утвержденный Приказом Министерства Промышленности Приднестровской Молдавской Республики от 29 ноября 2002 года N 483 (регистрационный N 1892 от 5 декабря 2002 года) (САЗ 02-49).
7. Пробы парфюмерно-косметических изделий для микробиологического анализа отбирают до отбора проб для физико-химических, органолептических и других видов испытаний с соблюдением правил асептики, для того чтобы исключить вторичное микробное загрязнение продукта.
8. От каждой партии парфюмерно-косметических изделий, подлежащих контролю, следует брать не менее трех единиц изделий в потребительской таре (упаковке), которая не должна иметь следов повреждений.
9. При испытаниях на стерильность от каждой партии парфюмерно-косметических изделий, независимо от ее объема, отбирают 10 ампул или 10 других единиц упаковки.
10. Пробу, отобранную от отдельной единицы упаковки, называют разовой. Количество продукта в разовых пробах из каждой единичной упаковки должно быть одинаковым. Разовые пробы соединяют, перемешивают и составляют среднюю пробу.
Глава 2. Подготовка проб к анализу
11. Подготовка проб для определения микробиологической чистоты:
а) перед вскрытием упаковки место соединения крышки с тарой обрабатывают 70 % - ным раствором этилового спирта. Первую порцию в количестве примерно 10 % содержимого упаковки отбрасывают, затем отбирают пробы и переносят в стерильную колбу или флакон вместимостью 100 - 200 см3;
б) для испытания готовят среднюю пробу не менее 15 г (см3) из упаковок, отобранных по пункту 8 настоящих методических указаний (далее МУ), и состоящую из равных разовых проб. Такое же количество упаковок используют и для повторных испытаний. В случае, если масса (объем) парфюмерно-косметического средства в единичной упаковке менее 5 г (см3), содержимое исследуют полностью или используют большее количество упаковок;
в) (5,0 +- 0,1) г (см3) или (10,0 +- 0,1) г (см3) средней пробы отбирают стерильно и помещают в стеклянные колбы или флаконы, содержащие соответственно (45 +- 1) см3 или (90 +- 1) см3 1 % - ного раствора твина-80 в физиологическом растворе. Смесь тщательно перемешивают в течение 15 - 30 минут до полной гомогенизации (либо помещают на аппарат для встряхивания). При необходимости пробы прогревают на водяной бане или в термостате от 40 °С до 45 °С, но не более 10 минут. Для гомогенизации продукции, плохо растворимой в воде, используют стерильные стеклянные бусы.
Эмульсии типа вода-масло подготавливают аналогичным способом, используя 4 % -ный раствор твина-80 в физиологическом растворе и предварительно (до встряхивания) прогревая на водяной бане или в термостате до в течение 20 минут.
Получают смесь, в 10 г (см3) которой содержится 1 г (см3) парфюмернокосметического средства - первое разведение 1:10 (10^-1). При необходимости делают последующие десятикратные 1:100 (10^-2) и 1:1000 (10-3) разведения;
г) полученные разведения используют для посевов. Время с момента окончания подготовки пробы до начала высева не должно превышать 30 минут;
д) определение собственной антимикробной активности парфюмерно-косметической продукции.
Метод основан на подавлении роста тест-штаммов микроорганизмов под действием испытуемого парфюмерно-косметического средства. В качестве тест-штаммов используют Bacillus subtilis АТСС 6633 (или Bacillus cereus АТСС 10702), Escherichia coli АТСС 25922, Pseudomonas aeruginosa АТСС 27853 (или Pseudomonas aeruginosa ГИСК 453, АТСС 9027), Staphylococcus aureus АТСС 25923 (или Staphylococcus aureus АТСС 6538-Р) и культуру Candida albicans АТСС 885-653.
Определение собственной антимикробной активности проводится для парфюмернокосметических средств, в состав которых входят консерванты и другие вещества, обладающие антимикробным действием.
Собственная антимикробная активность определяется однократно для каждой конкретной рецептуры парфюмерно-косметического средства.
Культуры Bacillus subtilis (Bacillus cereus), Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus выращивают на жидких средах при температуре (37 +- 1) °С в течение (19 +- 1) часов. Культуру Candida albicans выращивают на жидкой среде Сабуро при температуре (30 +- 1) °С в течение (48 +- 3) часов.
Из каждой выросшей культуры готовят взвесь микроорганизмов, добавляя физиологический раствор в соотношении 1:1000.
В пробирки вносят по 1 см3 первого разведения испытуемой пробы парфюмернокосметического средства, и добавляют:
1) в пробирку N 1 - 10 см3 буферного раствора и 1 см3 взвеси Bacillus subtilis (Bacillus cereus);
2) в пробирку N 2 - 10 см3 буферного раствора и 1 см3 взвеси Candida albicans;
3) в пробирку N 3 - 10 см3 одной из питательных сред и 1 см3 взвеси Escherichia coli;
4) в пробирку N 4 - 10 см3 одной из питательных сред и 1 см3 взвеси Pseudomonas aeruginosa;
5) в пробирку N 5 - 10 см3 одной из питательных сред и 1 см3 взвеси Staphylococcus aureus.
Контролем служат пробирки с питательными средами и соответствующими тестштаммами, в которые вместо испытуемого парфюмерно-косметического средства вносят то же количество стерильной дистиллированной воды.
Посевы инкубируют при (30 +- 1) °С в течение (48 +- 3) часов.
В случае отсутствия роста тест-штаммов микроорганизмов на соответствующих питательных средах отмечают антимикробное действие испытуемого средства.
Для устранения антимикробного действия входящих в состав парфюмернокосметических средств консервантов или веществ, обладающих антимикробным действием, среднюю пробу в количестве (5,0 +- 0,1) г (см3) или (10,0 +- 0,1) г (см3) отбирают стерильно и помещают в стеклянные колбы или флаконы, содержащие соответственно (45 +- 1) см3 или (90 +- 1) см3 4 % - ного раствора твина-80 в физиологическом растворе, или увеличивают разведение испытуемой пробы.
Дальнейшие испытания проводят в соответствии с методами анализа, которые описаны в разделе 3 настоящих МУ.
12. Подготовка проб к анализу на стерильность. Испытание парфюмернокосметических средств на стерильность проводят методом прямого посева или методом мембранных фильтров.
Метод мембранных фильтров не применим для суспензий или гомогенатов парфюмерно-косметических средств, загрязняющих при фильтрации поры фильтров.
а) перед вскрытием ампулы с парфюмерно-косметической продукцией обрабатываются этиловым спиртом. Шейка ампулы осторожно прогревается в пламени горелки. На хорошо прогретую шейку ампулы капают 1 каплю стерильного физиологического раствора. Ампулы осторожно вскрывают по месту образовавшейся в стекле трещины;
б) содержимое 10 ампул или 10 других упаковок объединяют в единую пробу. Из объединенной пробы отбирают стерильно (5,0 +- 0,1) г (см3) или (10,0 +- 0,1) г (см3) парфюмерно-косметического средства.
При испытаниях методом прямого посева отобранные пробы непосредственно засевают в соответствующие питательные среды.
При испытаниях методом мембранных фильтров отобранные пробы помещают в стеклянные колбы или флаконы, содержащие соответственно (45 +- 1) см3 или (90 +- 1) см3 стерильного 1 % - ного раствора твина-80 в физиологическом растворе, предварительно пропущенного через мембранный фильтр с размером пор (0,45 +- 0,02) мкм. Пробы тщательно перемешивают в течение 15 - 20 минут до полной гомогенизации.
При испытании масляных растворов пробы подготавливают аналогичным способом, используя 4 % - ный раствор твина-80 в физиологическом растворе и предварительно (до встряхивания) прогревая на водяной бане или в термостате от 40 °С до 45 °С в течение 20 минут.
Раздел 3. Методы анализа
13. При микробиологическом контроле парфюмерно-косметической продукции используют стандартизованные методы микробиологического посева. Определяют следующие группы микроорганизмов: мезофильные аэробные и факультативно-анаэробные микроорганизмы; дрожжи, дрожжеподобные и плесневые грибы; бактерии семейства Enterobacteriaceae; бактерии вида Staphylococcus aureus; бактерии вида Pseudomonas aeruginosa.
Глава 1. Определение общего количества мезофильных
аэробных и факультативно-анаэробных бактерий
14. Сущность метода. Метод основан на выявлении и количественном подсчете всех выросших колоний микроорганизмов при культивировании посевов в аэробных условиях при температуре (30 +- 1) °С в течение (72 +- 3) часов и пересчете их количества на 1 г (см3) исследуемого продукта.
15. Проведение анализа. Для определения общего количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных бактерий выбирают те разведения, при посеве которых на чашках вырастает не менее 15 и не более 300 колоний.
Посев осуществляют глубинным или двухслойным агаровым методами.
а) метод глубинного посева: по 1 см3 исследуемого материала из разведений высевают параллельно в две чашки Петри для каждого разведения. При посеве крышку чашки Петри слегка приоткрывают, и посевной материал вносят на дно чашки. Не позже чем через 15 минут после внесения материала, его заливают 15 - 20 см3 одной из сред по пункту 118 настоящих МУ, предварительно расплавленной и охлажденной до температуры (45 +- 1)°С. Чашки с посевами, залитыми питательной средой, осторожно вращают, чтобы посевной материал равномерно распределился по всей питательной среде. Затем чашки с посевами оставляют на горизонтальной поверхности до полного застывания питательной среды.
После застывания среды чашки помещают в термостат вверх дном и термостатируют при температуре (30 +- 1) °С в течение (72 +- 3) часов;
б) двухслойный агаровый метод: по 1 см3 исследуемого материала из приготовленных разведений вносят в каждую из двух пробирок с 4 см3 одной из сред по пункту 118 настоящих МУ, предварительно расплавленной и охлажденной до температуры (45 +- 1) °С. Быстро перемешивают содержимое пробирок и переносят в чашки Петри с застывшей средой, распределяя его равномерно по поверхности среды.
После застывания среды чашки помещают в термостат вверх дном и термостатируют при температуре (30 +- 1) °С в течение (72 +- 3) часа;
в) обработка результатов:
1) просмотр посевов осуществляется каждый день;
2) результаты оцениваются по каждой пробе отдельно;
3) подсчитывают количество колоний на тех чашках, где их выросло от 15 до 300, суммируют и находят среднее арифметическое из них.
Допускается учитывать колонии с помощью лупы с пятикратным увеличением.
Полученное среднее арифметическое число колоний округляют следующим образом:
1) если число меньше 100 - его округляют до ближайшего числа, кратного 5;
2) если число больше 100 и его последняя цифра 5 - его округляют до ближайшего числа, кратного 20;
3) если число больше 100 и его последняя цифра не 5 - его округляют до ближайшего числа, кратного 10.
Количество микроорганизмов в 1 г продукта (Х) вычисляют по формуле:
10N
X= a * ----- , где:
q
а - округленное среднее арифметическое число колоний;
q - объем посевного материала, внесенного в чашку, см3;
N - степень десятикратного разведения продукта.
Результаты анализа выражаются числом от 1,0 до 9,9, умноженным 10N, где N - соответствующая степень десятикратного разведения продукта.
Если на чашках с разведением 1:10 не обнаружено роста бактерий, то результат записывают так: менее 1,0 х 10^1 клеток на 1 г (см3).
Если на чашках выросло более 300 колоний, то посевы повторяют, используя более высокие разведения продукта.
Глава 2. Определение количества дрожжей,
дрожжеподобных и плесневых грибов
16. Сущность метода. Метод основан на выявлении и количественном подсчете всех выросших колоний микроорганизмов, типичных по макро - и (или) микроскопической морфологии, на селективной агаризованной питательной среде Сабуро, при культивировании посевов при температуре (30 +- 1) °С в течение (120 +- 3) часов.
17. Проведение анализа. Для определения количества дрожжей и плесневых грибов выбирают те разведения, при посеве которых на чашках вырастает не менее 15 и не более 150 колоний для дрожжей и не менее 5 и не более 50 - для плесеней.
Посев осуществляют глубинным или двухслойным агаровым методами.
а) метод глубинного посева:
по 1 см3 исследуемого материала из приготовленных разведений высевают параллельно в две чашки Петри для каждого разведения. При посеве крышку чашки Петри слегка приоткрывают, и посевной материал вносят на дно чашки. Не позже чем через 15 минут после внесения материала его заливают 15 - 20 см3 предварительно расплавленной и охлажденной до температуры (45 +- 1) °С агаризованной среды Сабуро. Чашки с посевами, залитыми питательной средой, осторожно вращают, чтобы посевной материал равномерно распределился по всей питательной среде. Затем чашки с посевами оставляют на горизонтальной поверхности до полного застывания питательной среды.
После застывания среды чашки помещают в термостат вверх дном и инкубируют при температуре (30 +- 1) °С в течение (120 +- 3) часов;
б) двухслойный агаровый метод:
по 1 см3 исследуемого материала из приготовленных разведений вносят в каждую из двух пробирок с 4 см3 предварительно расплавленной и охлажденной до температуры (45 +- 1) °С агаризованной среды Сабуро. Быстро перемешивают содержимое пробирок и переносят в чашки Петри с застывшей агаризованной средой Сабуро, распределяя его равномерно по поверхности среды.
После застывания среды чашки помещают в термостат вверх дном и инкубируют при температуре (30 +- 1) °С в течение (120 +- 3) часов;
в) обработка результатов:
результаты оцениваются по каждой пробе отдельно. Просмотр посевов осуществляется каждый день, предварительный учет типичных колоний проводят через (72 +- 3) часа термостатирования посевов, а окончательный - через (120 +- 3) часов.
На поверхности плотной среды рост и развитие дрожжей и дрожжеподобных грибов характеризуется появлением плоских или выпуклых колоний белого или кремового, иногда серо-белого цвета. В глубине агара дрожжи образуют чечевицеобразные колонии.
Развитие плесневых грибов характеризуется появлением сметанообразных, слизистых колоний различной окраски с последующим опушением.
Подсчитывают все выросшие колонии, суммируют и находят среднее арифметическое из них.
Допускается учитывать колонии с помощью лупы с пятикратным увеличением.
Полученное среднее арифметическое число колоний, если необходимо, округляют, как описано в пункте в) 14 настоящих МУ.
Количество дрожжей и плесневых грибов в 1 г (см3) продукта (Х) вычисляют по формуле:
10N
X = a * ----- , где:
q а - округленное арифметическое число колоний;
q - объем посевного материала, внесенного в чашку, см3;
N - степень десятикратного разведения продукта.
Результаты анализа выражаются числом от 1,0 до 9,9, умноженным на 10N, где N - соответствующая степень десятикратного разведения продукта.
Если на чашках с разведением 1:10 не обнаружено роста дрожжей и плесневых грибов, то результат записывают так: "не обнаружены".
Если на чашках выросло более 150 колоний, то посевы повторяют, используя более высокие разведения продукта.
Глава 3. Выявление и идентификация бактерий семейства
Enterobacteriaceae
18. К семейству Enterobacteriaceae относятся грамотрицательные неспорообразующие палочки, которые дают отрицательную оксидазную реакцию, ферментируют глюкозу с образованием кислоты и восстанавливают нитраты в нитриты.
19. Сущность метода. Метод основан на выявлении бактерий семейства Enterobacteriaceae с использованием накопительных и селективных питательных сред с дальнейшей идентификацией выявленных бактерий по биохимическим тестам.
20. Проведение испытания. 10 см3 исследуемого материала из разведения 10-1 вносят в стеклянный флакон вместимостью 200 см3, содержащий 100 см3 одной из питательных сред по пункту 121 настоящих МУ. Смесь перемешивают и инкубируют при температуре (37 +- 1) °С в течение 24 - 48 часов.
При наличии признаков роста на средах накопления (помутнение среды, изменение ее цвета) делают пересев петлей на чашки Петри со средой Эндо. Посевы инкубируют при температуре (37 +- 1) °С в течение 24 - 48 часов.
На среде Эндо бактерии семейства Enterobacteriaceae образуют колонии круглые, малиновые с металлическим блеском или без него, розовые, бесцветные, блестящие, выпуклые, диаметром 1 - 4 мм.
При окраске по Граму наблюдаются грамотрицательные неспорообразующие палочки.
При отсутствии роста на среде Эндо типичных для семейства Enterobacteriaceae колоний считают, что в образце нет представителей данного семейства.
Колонии, подозрительные по морфологии (каждую отдельно), пересевают петлей на одну из скошенных сред по пункту 121 настоящих МУ. Посевы инкубируют при (37 +- 1) °С в течение (24 +- 3) часов. Культуры проверяют на чистоту.
Чистые культуры исследуют на наличие фермента цитохромоксидазы, для чего полоску фильтровальной бумаги смачивают реактивом на обнаружение цитохромоксидазы и наносят бактериологической петлей или стеклянной палочкой суточную чистую культуру исследуемых бактерий. Синее окрашивание, появляющееся через 2-5 минут, свидетельствует о положительной оксидазной реакции.
При отрицательной оксидазной реакции культуры пересевают петлей на среду для определения ферментации глюкозы (допускается использование О/F-теста) и в среду для определения способности восстанавливать нитраты в нитриты.
В половину пробирок со средой для определения ферментации глюкозы вносят по 0,5 см3 стерильного вазелинового масла. Посевы инкубируют при (37 +- 1) °С в течение (24 +- 3) часов. При наличии роста, ферментацию глюкозы устанавливают по изменению цвета среды из красного в желтый в пробирках с маслом и без него.
При проведении О/F-теста посев производят уколом в два столбика со средой ХьюЛейфсена, один из которых заливают 1 см3 стерильного вазелинового масла. Посевы инкубируют при (37 +- 1) °С в течение (24 +- 3) часов. При положительной реакции происходит изменение цвета среды при культивировании, как в аэробных, так и в анаэробных условиях.
О наличии нитритов в среде судят по появлению красного окрашивания при внесении в среду реактива Грисса. Для чего к суточной исследуемой культуре на среде для определения наличия нитритов приливают 0,2 - 0,3 см3 реактива Грисса, погружая пипетку до дна пробирки. Появление красного окрашивания свидетельствует о наличии нитритов.
21. Обработка результатов. Если в исследуемом образце обнаружены грамотрицательные неспорообразующие палочки, которые дают отрицательную оксидазную реакцию, ферментируют глюкозу с образованием кислоты и восстанавливают нитраты в нитриты, это значит, что парфюмерно-косметическое средство контаминировано бактериями семейства Enterobacteriaceae.
Глава 4. Выявление и идентификация Pseudomonas aeruginosa
22. Микроорганизмы вида Pseudomonas aeruginosa представляют собой грамотрицательные неспорообразующие палочки, которые дают положительную оксидазную реакцию, образуют проникающий в субстрат пигмент феназинового ряда, имеющий буроватый оттенок с вариантами от сине-зеленого цвета (пиоцианин) до коричнево-красного, и способны к росту при температуре (42 +- 1) °С.
23. Сущность метода. Метод основан на выявлении бактерий вида Pseudomonas aeruginosa с использованием накопительных и селективных питательных сред с дальнейшей идентификацией выявленных бактерий по биохимическим тестам.
24. Проведение испытаний. 10 см3 исследуемого материала из разведения 10-1 вносят в стеклянный флакон вместимостью 200 см3, содержащий 100 см3 одной из питательных сред по пункту 122 настоящих МУ. Смесь перемешивают и инкубируют при температуре (37 +- 1) °С в течение 24 - 48 часов.
При наличии признаков роста в среде накопления делают пересев петлей на чашки с одной из питательных сред. Посевы инкубируют при температуре (37 +- 1) °С в течение 24 - 48 часов.
При наличии роста зеленоватых, флюоресцирующих колоний, обладающих характерным запахом и окрашивающих среду, из них делают мазки и окрашивают по Граму.
Колонии, подозрительные по морфологии (каждую отдельно), пересевают петлей на одну из скошенных сред по пункту 123 настоящих МУ.
Посевы инкубируют при (37 +- 1) °С в течение (24 +- 3) часов. Культуры проверяют на чистоту.
Чистые культуры колоний исследуют на наличие цитохромоксидазы. Для чего полоску фильтровальной бумаги смачивают реактивом на обнаружение цитохромоксидазы и наносят бактериологической петлей или стеклянной палочкой суточную чистую культуру исследуемых бактерий. Синее окрашивание, появляющееся через 2-5 минут, свидетельствует о положительной оксидазной реакции.
Оксидазоположительные колонии пересевают петлей на среду Кинг-А и инкубируют при температуре (37 +- 1) °С в течение 24 - 48 часов.
На среде Кинг-А культура Pseudomonas aeruginosa образует пигмент феназинового ряда, имеющий буроватый оттенок с вариантами от сине-зеленого (пиоцианин) до коричнево-красного цвета и проникающий в субстрат.
Для дополнительного подтверждения принадлежности в виду Pseudomonas aeruginosa чашки со средой Кинг-А инкубируют при температуре (42 +- 1) °С в течение (24 +- 3) часов.
Культура Pseudomonas aeruginosa растет в вышеуказанных условиях с образованием сине-зеленого пигмента.
25. Обработка результатов. Если в результате исследований обнаружены колонии грамотрицательных неспорообразующих палочек, дающих положительную оксидазную реакцию, образующие пигмент или без него и дающие рост при 42 °С, считают, что парфюмерно-косметическое средство контаминировано Pseudomonas aeruginosa.
Глава 5. Выявление и идентификация Staphylococcus aureus
26. Микроорганизмы вида Staphylococcus aureus представляют собой грамположительные кокки, обладающие лецитиназной активностью, сбраживающие маннит в аэробных и анаэробных условиях или мальтозу в анаэробных условиях и дающие положительную реакцию плазмокоагуляции.
27. Сущность метода. Метод основан на выявлении бактерий вида Staphylococcus aureus с использованием накопительных и селективных питательных сред с дальнейшей идентификацией выявленных бактерий по биохимическим тестам.
28. Проведение испытаний. 10 см3 исследуемого материала из разведения 10^-1 вносят в стеклянный флакон вместимостью 200 см3, содержащий 100 см3 одной из питательных сред. Смесь перемешивают и инкубируют при температуре (37 +- 1) °С в течение 24 - 48 часов.
При наличии признаков роста делают пересев петлей на чашки с одной из сред: желточно-солевой агар или Байрд-Паркер агар или маннитно-солевой агар. Посевы на желточно-солевом и Байрд-Паркер агарах инкубируют при температуре (37 +- 1) °С в течение (48 +- 3) часов, а посевы на маннитно-солевом агаре - в течение 24 - 48 часов.
При росте на желточно-солевом агаре Staphylococcus aureus образует круглые, слегка возвышающиеся над поверхностью агара колонии, с ровными краями, диаметром 2-2,5 мм, окрашенные в желтый, золотистый, кремовый, палевый или белый цвет, окруженные зоной лецитиназной активности.
На среде Байрд-Паркер Staphylococcus aureus растет в виде черных блестящих колоний диаметром 1 - 1,5 мм, окруженных зоной лецитиназной активности.
Наличие на маннитно-солевом агаре колоний, окруженных желтыми зонами, свидетельствует о способности этих микроорганизмов ферментировать маннит.
Из подозрительных по морфологии колоний делают мазки и окрашивают по Граму. Стафилококки по Граму окрашиваются положительно, имеют шарообразную или близкую к ней форму с диаметром 0,6 - 1,0 мкм и располагаются обычно в виде скоплений, напоминающих гроздья винограда.
При обнаружении грамположительных кокков делают пересев на одну из скошенных сред, приготовленных по пункту 125 настоящих МУ. Посевы инкубируют при (37 +- 1) °С в течение (24 +- 3) часов.
Выделенную чистую культуру пересевают в среду Гисса с маннитом или мальтозой, разлитую высоким столбиком (посев производят уколом). Инкубируют при (37 +- 1) °С в течение (24 +- 3) часов.
В случае роста стафилококков на среде Гисса с маннитом или мальтозой наблюдается ферментация или окисление углевода, сопровождающиеся изменением цвета среды.
Выделенную чистую культуру исследуют на наличие фермента плазмокоагулазы.
Для проведения реакции в стерильную пробирку с 0,5 - 1,0 см3 плазмы крови кролика, разведенной в 3 - 4 раза или приготовленной из сухого препарата промышленного производства, вносят одну петлю суточной агаровой культуры. Одну пробирку с плазмой крови оставляют незасеянной для контроля. Содержимое пробирок перемешивают и инкубируют при (37 +- 1) °С в течение (24 +- 3) часов. Результат учитывают через 2, 4, 6 и 24 часов.
При отсутствии свертывания плазмы через 24 часа исследуемую культуру относят к коагулазоотрицательной.
Реакцию считают положительной при образовании даже небольшого сгустка.
29. Обработка результатов. Если в результате исследований обнаружены колонии грамположительных кокков, ферментирующие маннит в аэробных и анаэробных условиях или мальтозу в анаэробных условиях, обладающие лецитиназной активностью и дающие положительную реакцию плазмокоагуляции, считают, что парфюмерно-косметическое средство контаминировано Staphylococcus aureus.
Глава 6. Испытание на стерильность
26. Метод прямого посева:
а) сущность метода: метод основан на способности основного большинства как аэробных, так и анаэробных бактерий давать видимый рост на тиогликолевой среде, а дрожжей, дрожжеподобных и плесневых грибов на среде Сабуро;
б) проведение испытания: из объединенной пробы отбирают стерильно по (5,0 +- 0,1) г (см3) или (10,0 +- 0,1) г (см3) испытуемого средства и высевают в два стеклянных флакона (параллельные определения) вместимостью 100 или 200 см3, содержащие 50 или 100 см3 жидкой среды Сабуро и 50 или 100 см3 тиогликолевой среды соответственно.
Посевы в среде Сабуро инкубируют при температуре (30 +- 1) °С, а посевы в тиогликолевой среде при температуре от 30 °С до 35 °С в течение 14 суток. Посевы просматривают ежедневно.
31. Метод мембранных фильтров:
а) сущность метода: метод мембранных фильтров основан на фильтрации растворов через мембранные фильтры с размером пор не более (0,45 +- 0,02) мкм, на которых улавливается основное количество микроорганизмов, с последующим культивированием их в тиогликолевой среде и в жидкой среде Сабуро;
б) проведение испытания: фильтрование проводят в стерильных условиях с использованием фильтрационной установки, включающей фильтродержатель, соединенный с колбой приемником. Фильтродержатель состоит из воронки с крышкой и основания из пористой пластины, на которую помещается мембранный фильтр.
Фильтрационную установку стерилизуют любым способом, обеспечивающим сохранность рабочих характеристик мембран, а также стерильность мембран и всей установки.
Для фильтрации используют нитратцеллюлозные мембранные фильтры с размером пор (0,45 +- 0,02) мкм, диаметром около 47 мм. Фильтрование проводят под вакуумом.
Для фильтрования продуктов, содержащих небольшое количество взвешенных частиц, используют предварительную фильтрацию через префильтр.
Пробу, немедленно фильтруют. Фильтрацию заканчивают в момент исчезновения влаги на поверхности фильтра. После окончания фильтрации мембрану отмывают 3 - 5 порциями по 100 см3 стерильного физиологического раствора для полного удаления с поверхности фильтра веществ, препятствующих росту микроорганизмов.
После отмывания мембрану немедленно извлекают из фильтродержателя, разрезают стерильными ножницами пополам и одну половину помещают в стеклянный флакон вместимостью 100 или 200 см3, содержащий 50 или 100 см3 жидкой среды Сабуро, а вторую половину - в стеклянный флакон, содержащий 50 или 100 см3 тиогликолевой среды соответственно.
Посевы в среде Сабуро инкубируют при температуре (30 +- 1) °С, а посевы в тиогликолевой среде - при температуре от 30 °С до 35 °С в течение 7 суток. Посевы просматривают ежедневно.
32. Обработка результатов. Посевы просматривают в рассеянном свете ежедневно и по окончании периода инкубации. Наличие роста микроорганизмов в питательных средах оценивают визуально по появлению мутности пленки, осадка и других макроскопических изменений. Выявленный рост микроорганизмов подтверждают микроскопированием.
Испытуемая продукция считается стерильной при отсутствии роста микроорганизмов.
При обнаружении роста хотя бы в одном флаконе его подтверждают микроскопированием и повторяют испытание на таком же количестве образцов, как и в первый раз. В случае роста при повторном испытании микроорганизмов, морфологически сходных с микроорганизмами, выявленными при первичном посеве, испытуемую продукцию считают нестерильной. Если при повторном посеве наблюдается рост микроорганизмов, отличающихся по морфологии от первоначально выделенных, испытание проводят в третий раз на удвоенном количестве образцов. При наличии роста хотя бы в одном флаконе при третьем испытании косметическую продукцию считают нестерильной.
Раздел 4. Микробиологические нормативы
для парфюмерно-косметической продукции
33. Микробиологическому контролю подлежат средства для ухода за кожей лица и тела (косметические кремы, кремообразные маски, косметическое молочко, косметические эмульсии, шампуни, жидкие мыла, гели для душа и ванн, пены для ванн, бальзамы, дезодоранты, депилятории, средства для и после бритья, лосьоны-тоники, лосьоны, тоники), средства декоративной косметики (средства для глаз: жидкая тушь, средства для подведения линии глаз, компактные сухие и жидкие тени для век, губная помада, пудра, румяна компактные и кремообразные), детская косметика и парфюмерия, средства для ухода за волосами (шампуни, ополаскиватели, бальзамы, маски, средства для укладки волос и другие), средства интимной гигиены, специальная косметическая продукция (средства для загара, фотозащитные средства и другие), косметические средства разового использования (в ампулах, капсулах и другие), душистые воды.
Обязательному микробиологическому контролю также подлежит сырье природного и синтетического происхождения и другие компоненты, входящие в состав косметических средств (биологически активные вещества - действующее начало, ингредиенты основы - структурообразующие эмульгаторы, поверхностно-активные компоненты, солюбилизаторы, консерванты и другие).
Не подлежат обязательному микробиологическому контролю готовые средства, содержащие более 25 % этилового спирта, окислительные краски для волос и ногтей.
Микробиологические показатели безопасности парфюмерно-косметической продукции приведены в таблице настоящих МУ.
Таблица
----------------------------------------------------------------------------------------------------------
| Группы | Вид | Общее | Дрожжи, | Бактерии | Staphy - | Pseudomonas |
| | косметической | количество | дрожжеподобные | семейства | lococcus | aeruginosa |
| | продукции | мезофильных | и плесневые | Enterobac- | aureus | |
| | | аэробных и | грибы | teriaceae | | |
| | | факультативно | | | | |
| | | анаэробных | | | | |
| | | бактерий МАФАнМ | | | | |
| | |-------------------------------------------------------------| |
| | | КОЕ в 1 г (cм3) продукции | |
|------------|---------------|---------------------------------------------------------------------------|
| I Группа | Ампульная | |
| | косметика, | |
| | используемая | Стерильная продукция |
| | для введения | |
| | методом | |
| | электрофореза | |
|------------|---------------|---------------------------------------------------------------------------|
| II Группа | Детская | Не более 1х10^2 | Отсутствие | Отсутствие | Отсутствие | Отсутствие |
| | косметика. | | | | | |
| | Косметика | | | | | |
| | для глаз | | | | | |
|------------|---------------|-----------------|-----------------|------------|------------|-------------|
| III Группа | Остальная | Не более 1х10^3 | Не более 1х10^2 | Отсутствие | Отсутствие | Отсутствие |
| | косметика | | | | | |
----------------------------------------------------------------------------------------------------------
Раздел 5. Аппаратура, растворы реактивов, питательные среды
Глава 1. Аппаратура
34. Весы лабораторные квадрантные среднего класса точности
с наибольшим пределом взвешивания 500 г ГОСТ 24104-2001.
Весы лабораторные специального класса точности
с наибольшим пределом взвешивания 200 г ГОСТ 24104-2001.
35. рН - метр любой марки с набором электродов.
36. Термометр ртутный с диапазоном измерения от 0 °С до 100 °С
ГОСТ 28498-90.
37. Автоклав (паровой стерилизатор) ГОСТ 19569-89.
38. Термостаты, позволяющие поддерживать температуру до 50 °С.
39. Баня водяная.
40. Дистиллятор любой марки.
41. Шкаф сушильный стерилизационный.
42. Электроплитка (или газовая плита).
43. Прибор вакуумного фильтрования.
44. Спиртовка лабораторная стеклянная ГОСТ 25336-82.
45. Лупа с пятикратным увеличением.
Глава 2. Питательные среды и реактивы
46. Агар микробиологический ГОСТ 17206-96.
47. Агар сухой питательный для культивирования микроорганизмов.
48. Агар Эндо.
49. Бромкрезоловый пурпурный (индикатор).
50. Вода дистиллированная ГОСТ 6709-72.
51. Вода мясная ГОСТ 10444.1-84.
52. Глюкоза ГОСТ 6038-79.
53. Гидролизат казеина панкреатический.
54. Глицерин ГОСТ 6824-96.
55. Желчь сухая медицинская.
56. Калий азотнокислый ГОСТ 4217-77.
57. Калий сернокислый ГОСТ 4145-74.
58. Калий фосфорнокислый однозамещенный ГОСТ 4198-75.
59. Калий фосфорнокислый двузамещенный ГОСТ 2493-96.
60. Калия теллурит, раствор массовой концентрацией 2 %.
61. Кислота соляная, раствор массовой
концентрацией (НСl) = 0,1 моль/дм3 ГОСТ 3118-77.
62. Кислота сульфаниловая ГОСТ 5821-78.
63. Кислота тиогликолевая.
64. Кислота уксусная ледяная ГОСТ 61-75.
65. Литий хлористый 6-водный
66. Магний хлористый 6-водный ГОСТ 4209-77.
67. Малахитовый зеленый, индикатор.
68. Маннит.
69. Мальтоза.
70. Масло вазелиновое ГОСТ 3164-78.
71. Масло иммерсионное ГОСТ 13739-78.
72. Метиленовый синий.
73. Натрия гидроокись, раствор массовой
концентрацией (NaОН) = 0,1 моль/ дм3 ГОСТ 4328-77.
74. Натрия резазурин, раствор массовой концентрацией 1,0 г/дм3.
75. Натрий сернистокислый, раствор массовой концентрацией (Na
2SO3) = 0,1 г/ дм3.
76. Натрия тиогликолят.
77. Натрий хлористый ГОСТ 4233-77.
78. Натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный ГОСТ 245-76.
79. Натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный ГОСТ 4172-76.
80. N,N-диметил-п-фенилендиамин дигидрохлорид, раствор массовой
концентрацией 1 %.
81. alpha - Нафтиламин.
82. alpha - нафтол, спиртовый раствор массовой концентрацией 1 %.
83. Основа бактериологических питательных сред сухая
(Бактофок-МК).
84. Пептон сухой ферментативный для бактериологических целей
ГОСТ 13805-76.
85. Питательная среда N 1 (для культивирования аэробных и
факультативно-анаэробных микроорганизмов), сухая.
86. Питательная среда N 2 (для выращивания плесневых грибов),
сухая.
87. Питательная среда N 3 (обогащения для бактерий семейства
Enterobacteriaceae), сухая.
88.Питательная среда N 6 (для определения ферментации глюкозы).
89. Питательная среда N 7 (для определения реакции нитратов в
нитриты), сухая.
90. Питательная среда N 8 (для выращивания Р. aeruginosa и S.
aureus), сухая.
91. Питательная среда N 9 (для выявления пигмента пиоцианина Р.
aeruginosa), сухая.
92. Питательная среда N 10 (для идентификации S. aureus), сухая.
93. Питательная среда для контроля стерильности, сухая.
94. Плазма кролика, сухая, цитратная для реакции
плазмокоагуляции.
95. Цистин (цистеин).
96. Растворы и реактивы для окраски мазков по Граму
ГОСТ 10444.1-84.
97. Спирт этиловый ректификованный ГОСТ ПМР ГОСТ Р 51652-2003.
98. Спирт этиловый ректификованный технический ГОСТ 18300-87.
99. Феноловый красный, индикатор.
100. Экстракт дрожжевой.
Глава 3. Материалы
101. Бумага индикаторная универсальная.
102. Вата медицинская гигроскопическая ГОСТ 5556-81.
103. Марля медицинская ГОСТ 9412-93.
104. Колбы плоскодонные конические или круглые
разной вместимости ГОСТ 25336-82.
105. Пипетки разной вместимости 2 класса точности.
ГОСТ 29228-91.
106. Пробирки типов П1 и П2 ГОСТ 25336-82.
107. Штативы для пробирок.
108. Шпатели.
109. Чашки Петри диаметром 90 - 100 мм ГОСТ 25336-82.
110. Цилиндры на 100 - 250 см 3 ГОСТ 1770-74.
111. Флаконы стеклянные градуированные
вместимостью 100, 200, 500 мл ГОСТ 10782-85.
112. Фильтры мембранные типа МФАС-Б5
или МФА-МА-N 5 диаметр 47 мм, размер пор 0,45 мкм.
113. Фильтры мембранные типа HAWG (Мillipore) диаметр 47 мм,
размер пор 0,45 мкм.
114. Фильтры мембранные типа АР 15 (Мillipore) диаметр 47 мм.
Допускается применение средств измерений, вспомогательного оборудования с аналогичными метрологическими и техническими характеристиками, а также реактивов, материалов и питательных сред по качеству не ниже указанных.
Глава 4. Приготовление растворов реактивов и питательных сред
115. Для приготовления растворов реактивов и питательных сред используют дистиллированную воду, если нет специальных указаний, и реактивы квалификации "химически чистые" или "чистые для анализа".
116. Необходимое значение рН растворов и питательных сред устанавливают с помощью раствора гидроокиси натрия, раствор концентрации (NаОН) = 0,1 моль/дм3 или раствора соляной кислоты, раствор концентрации (HCl) = 0,1 моль/ дм3.
Значение рН растворов определяют при температуре (20 +- 2) °С.
Ориентировочное определение рН растворов и питательных сред допускается проводить с помощью индикаторной бумаги.
117. Изотонический 0,85 % - ный раствор хлористого натрия (физиологический раствор):
0,85 г хлористого натрия растворяют в 100 см3 дистиллированной воды и стерилизуют при температуре (121 +- 1) °С в течение 15 минут.
Хранят при комнатной температуре не более 14 суток.
118. Раствор твина-80. 1,0 г или 4,0 г твина-80 растворяют соответственно в 99 см3 или в 96 см3 физиологического раствора, фильтруют через ватно-марлевый фильтр и стерилизуют при температуре (121 +- 1) °С в течение 15 минут.
Хранят при комнатной температуре не более 14 суток.
119. Раствор фенолового красного массовой концентрацией 1 %. 1,0 г фенолового красного растирают в ступке, добавляя небольшими порциями 28,2 см3 раствора натрия гидроокиси массовой концентрацией 0,01 моль/дм3. Раствор переносят в мерную колбу, вместимостью100 см3 и доводят водой до метки.
Хранят во флаконе из темного стекла при температуре от 4 °С до 10 °С.
120. Раствор малахитового зеленого массовой концентрацией 0,5 %. 0,5 г малахитового зеленого помещают в стерильный флакон, заливают 100 см3 горячей дистиллированной воды и помещают на сутки в термостат с температурой (37 +- 1) °С, периодически перемешивая.
Хранят во флаконе из темного стекла при температуре от 4 °С до 10 °С.
121. Реактив Грисса:
а) раствор N 1: 0,5 г кислоты сульфаниловой растворяют в 30 см3 кислоты уксусной ледяной, прибавляют 100 см3 воды, фильтруют через бумажный фильтр. Раствор годен в течение месяца;
б) раствор N 2: 0,1 г alpha - нафтиламина растворяют в 100 см3 кипящей воды, охлаждают, прибавляют 30 см3 кислоты уксусной ледяной, фильтруют через бумажный фильтр.
Раствор годен в течение 7 суток.
Перед употреблением смешивают равные объемы растворов N 1 и N 2.
122. Реактив для определения наличия фермента цитохромоксидазы:
а) раствор N 1: 1,0 г alpha - нафтола растворяют в 100 см3 спирта этилового;
б) раствор N 2: 1,0 г N,N-диметил-п-фенилендиамин дигидрохлорида растворяют в 100 см3 дистиллированной воды.
Перед использованием смешивают растворы N 1 и N 2 в соотношении 2 : 3.
Хранят во флаконах нейтрального светозащитного стекла при температуре от 4 до 10 °С в течение 14 суток.
123. Среды для культивирования аэробных и факультативно анаэробных бактерий:
а) мясо-пептонный агар с глюкозой:
1) пептон 10,0 г;
2) мясная вода 1000 см3;
3) натрия хлорид 5,0 г;
4) глюкоза 1,0 г;
5) агар микробиологический 13,0 г.
Все ингредиенты растворяют в мясной воде. Прибавляют замоченный заранее агар и нагревают до полного его расплавления. Устанавливают рН = 7,3 +- 0,1. Фильтруют через ватно-марлевый фильтр и разливают во флаконы. Стерилизуют при температуре (121 +- 1) °С в течение 15 минут. Хранят при температуре от 4 °С до 10 °С;
б) питательный агар "МК" с глюкозой:
1) бактофок-МК 20,0 г;
2) натрия хлорид 5,0 г;
3) глюкоза 1,0 г;
4) агар микробиологический 13,0 г;
5) вода дистиллированная 1000 см3.
Все ингредиенты растворяют в воде. Прибавляют замоченный заранее агар, нагревают до полного его расплавления, устанавливают рН = 7,3 +- 0,1, фильтруют через ватномарлевый фильтр, разливают во флаконы. Стерилизуют при температуре (121 +- 1) °С в течение 15 минут. Хранят при температуре от 4 °С до 10 °С.
Допускается использовать агар сухой питательный для культивирования микроорганизмов или питательную среду N 1 сухую.
124. Среды для выращивания грибов:
а) (среда Сабуро):
1) пептон или Бактофок-МК 10,0 г;
2) глюкоза или мальтоза 40,0 г;
3) агар микробиологический 13,0 г;
4) вода дистиллированная 1000 см3.
Все ингредиенты растворяют в воде, нагревают до полного растворения всех компонентов, устанавливают рН = 5,8 +- 0,2, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают во флаконы и стерилизуют при температуре (121 +- 1) °С в течение 15 минут. Хранят при температуре от 4 °С до 10 °С. Допускается использовать питательную среду N 2 сухую;
б) среда Сабуро жидкая:
1) пептон 10,0 г;
2) глюкоза или мальтоза 40,0 г;
3) вода дистиллированная 1000 см3.
Все ингредиенты растворяют в воде, нагревают до полного растворения всех компонентов, устанавливают рН = 5,8 +- 0,2, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают во флаконы и стерилизуют при температуре (121 +- 1) °С в течение 15 минут. Хранят при температуре от 4 °С до 10 °С не более 14 суток.
125. Среды обогащения для бактерий семейства Enterobacteriaceae:
а) среда для выращивания бактерий семейства Enterobacteriaceae:
1) пептон или Бактофок-МК 20,0 г;
2) глюкоза 10,0 г;
3) натрия фосфат двузамещенный 7,5 г;
4) калия фосфат однозамещенный 2,5 г;
5) феноловый красный 0,08 г;
6) малахитовый зеленый 0,015 г;
7) вода дистиллированная 1000 см3.
Питательную основу и соли растворяют в дистиллированной воде при нагревании, вносят глюкозу, прибавляют 8 см3 1 % - ного раствора фенолового красного и 3 см3 0,5 % - ного малахитового зеленого, устанавливают рН = 7,5 +- 0,1, нагревают до полного растворения компонентов, фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Стерилизуют при температуре (121 +- 1) °С в течение 15 минут. Хранят при температуре от 4 °С до 10 °С не более 14 суток;
б) среда Мак-Конки:
1) пептон или Бактофок-МК 20,0 г;
2) лактоза 10,0 г;
3) желчь сухая 5,0 г;
4) бромкрезоловый пурпурный 0,01 г;
5) вода дистиллированная 1000 см3.
Все ингредиенты растворяют в воде, нагревают до полного растворения компонентов, устанавливают рН = 7,5 +- 0,1, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают во флаконы и стерилизуют при температуре (121 +- 1) °С в течение 15 минут.
Хранят при температуре от 4 °С до 10 °С не более 14 суток.
Допускается использовать питательную среду N 3 сухую.
126. Питательные среды для идентификации бактерий семейства Enterobacteriaceae:
а) агар Эндо: среду готовят, как указано на этикетке или по следующей прописи.
К 100 см3 питательного агара, соблюдая правила асептики, добавляют 1 г лактозы, растворенной в 5 см3 стерильной воды. Затем подогревают на кипящей водяной бане в течение 5 минут.
В отдельную пробирку наливают 1 см3 насыщенного спиртового раствора фуксина основного, к которому добавляют свежеприготовленный водный раствор натрия сернистокислого массовой концентрацией 10 % до обесцвечивания фуксина (бледнорозовый цвет). Полученную смесь добавляют в расплавленный лактозный агар, перемешивают, избегая вспенивания, и разливают в чашки Петри. Хранят при температуре от 4 °С до 10 °С не более 5 суток;
б) среда для определения ферментации глюкозы:
1) пептон или Бактофок-МК 10,0 г;
2) глюкоза 40,0 г;
3) натрия хлорид 5,0 г;
4) феноловый красный 0,08 г;
5) вода дистиллированная 1000 см3.
Питательную основу и натрия хлорид растворяют в дистиллированной воде при нагревании, вносят глюкозу, прибавляют 8 см3 1 % - ного раствора фенолового красного, устанавливают рН = 7,4 +- 0,2, кипятят 1 минуту, фильтруют и разливают в пробирки с поплавками по 4 - 5 см3. Стерилизуют при температуре (121 +- 1) °С в течение 15 минут. Затем как можно быстрее охлаждают среду.
Хранят при температуре от 4 °С до 10 °С не более 14 суток.
Допускается использовать среду N 6 сухую;
в) среда для определения восстановления нитратов в нитриты:
1) пептон или Бактофок-МК 5,0 г;
2) натрия хлорид 5,0 г;
3) калия нитрат 1,5 г;
4) вода дистиллированная 1000 см3.
Все ингредиенты растворяют в воде при нагревании, устанавливают рН = 7,4 +- 0,2, кипятят одну минуту, фильтруют через бумажный фильтр и разливают в пробирки по 5 см3. Стерилизуют при температуре (121 +- 1) °С в течение 15 минут.
Хранят при температуре от 4 °С до 10 °С не более 14 суток.
Допускается использовать питательную среду N 7 сухую;
г) среда Хью-Лейфсена:
1) пептон или Бактофок-МК 2,0 г;
2) глюкоза 10,0 г;
3) натрия хлорид 5,0 г;
4) калий фосфорнокислый двузамещенный 0,3 г;
5) бромтимоловый синий 0,03 г;
6) агар микробиологический 3,0 г;
7) вода дистиллированная 1000 см3.
Ингредиенты растворяют в воде, добавляют заранее замоченный агар, нагревают до полного растворения всех компонентов, кипятят 2 - 3 минуты, устанавливают рН = 7,4 +- 0,1, добавляют 3 см3 1 % - ного водного раствора бромтимолового синего. Среду фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают в пробирки по 10 см3 и стерилизуют при температуре (112 +- 1) °С в течение 15 минут.
Цвет среды до автоклавирования - синий, после - травянисто-зеленый.
Хранят при температуре от 4 °С до 10 °С не более 14 суток.
127. Среды для выращивания Pseudomonas aeruginosa:
а) мясо-пептонный бульон с глюкозой:
1) пептон 10,0 г;
2) мясная вода 1000 см3;
3) натрия хлорид 5,0 г;
4) глюкоза 1,0 г.
Все ингредиенты растворяют в мясной воде, нагревают до полного растворения всех компонентов, устанавливают рН = 7,3 +- 0,2, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают во флаконы и стерилизуют при температуре (121 +- 1) °С в течение 15 минут.
Хранят при температуре от 4 °С до 10 °С не более 14 суток;
б) питательный бульон "МК" с глюкозой:
1) бактофок-МК 10,0 г;
2) натрия хлорид 5,0 г;
3) глюкоза 1,0 г;
4) вода дистиллированная 1000 см3.
Все ингредиенты растворяют в воде, нагревают до полного растворения компонентов, устанавливают рН = 7,3 +- 0,2, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают во флаконы и стерилизуют при температуре (121 +- 1) в течение 15 минут. Хранят при температуре от 4 °С до 10 °С не более 14 суток;
в) среда для выращивания Р. aeruginosa:
1) пептон или Бактофок-МК 10,0 г;
2) глюкоза 2,5 г;
3) натрия хлорид 5,0 г;
4) калий фосфорнокислый двузамещенный 2,5 г;
5) вода дистиллированная 1000 см3.
Питательную основу и натрия хлорид растворяют в дистиллированной воде при нагревании, вносят глюкозу, устанавливают рН = 7,3 +- 0,2, кипятят 1 минуту, фильтруют через бумажный фильтр и стерилизуют при температуре (121 +- 1) °С в течение 15 минут. Хранят при температуре от 4 °С до 10 °С не более 14 суток.
128. Среда для выявления пигмента пиоцианина (Среда Кинг - А):
а) пептон или Бактофок-МК 20,0 г;
б) магния хлорид безводный 5,0 г;
в) калия сульфат безводный 1,0 г;
г) глицерин 10 см3;
д) агар микробиологический 13,0 г;
е) вода дистиллированная 1000 см3.
Все ингредиенты, кроме глицерина и агара, растворяют в воде и оставляют на 15 минут. Затем вносят глицерин, тщательно перемешивают, растворяют при нагревании, устанавливают рН = 7,4 +- 0,2, кипятят 1 минуту, прибавляют замоченный заранее агар, нагревают до полного его расплавления, фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Стерилизуют при температуре (121 +- 1) °С в течение 15 минут.
Хранят при температуре от 4 °С до 10 °С не более 14 суток.
Допускается использовать питательную среду N 9 сухую.
129. Среды для выращивания Staphylococcus aureus:
а) солевой бульон:
в 1000 см3 мясо-пептонного бульона вносят 65,0 г натрия хлористого, перемешивают до полного растворения соли, разливают во флаконы и стерилизуют при температуре (121 +- 1) °С в течение 15 минут.
Хранят при температуре от 4 °С до 10 °С не более 14 суток;
б) среда с глюкозой:
1) пептон или Бактофок-МК 10,0 г;
2) глюкоза 2,5 г;
3) натрия хлорид 5,0 г;
4) калий фосфорнокислый двузамещенный 2,5 г;
5) вода дистиллированная 1000 см3.
Питательную основу и натрия хлорид растворяют в дистиллированной воде при нагревании, вносят глюкозу, устанавливают рН = 7,3 +- 0,2, кипятят 1 минуту, фильтруют через бумажный фильтр и стерилизуют при температуре (121 +- 1) °С в течение 15 минут. Хранят при температуре от 4 °С до 10 °С не более 14 суток.
130. Среды для идентификации Staphylococcus aureus:
а) желточно-солевой агар:
эмульсия яично-желточная: куриное яйцо протирают ватой, смоченной этиловым спиртом, помещают в стерильную чашку Петри, стерильным инструментом пробивают с противоположных сторон яйца два отверстия. Через одно отверстие полностью удаляют белок, затем, увеличив отверстие, выливают желток в стерильную колбу с 50 см3 физиологического раствора, содержимое встряхивают до получения однородной массы.
Хранят при температуре от 4 °С до 10 °С.
В 100 см3 мясо-пептонного агара с глюкозой, расплавленный и охлажденный до 50 °С, вносят 9,5 г натрия хлористого и 10 см3 яично-желточной эмульсии. Смесь перемешивают до полной гомогенизации компонентов и разливают в чашки Петри.
Хранят при температуре от 4 °С до 10 °С не более 5 суток;
б) агар Байрд-Паркер:
основа среды: в 1000 см3 мясо-пептонного бульона с глюкозой вносят 17,9 г лития хлористого, 15 г агара микробиологического, 5 см3 экстракта дрожжевого, перемешивают и нагревают до полного растворения компонентов. Охлаждают до 50 °С, устанавливают рН = 6,9 +- 0,1, разливают во флаконы по 100 см3 и стерилизуют при температуре (121 +- 1) °С в течение 15 минут. Хранят при температуре от 4 °С до 10 °С не более 14 суток.
Перед употреблением к 100 см3 расплавленной и охлажденной до 50 °С основы среды прибавляют 0,5 см3 2 % - ного раствора калия теллурита и 5 см3 яично-желточной эмульсии. Среду перемешивают до полной гомогенизации компонентов и разливают в чашки Петри. Перед посевом чашки подсушивают в термостате.
Хранят при температуре от 4 °С до 10 °С не более 48 часов;
в) маннитно-солевой агар:
1) пептон или Бактофок-МК 10,0 г;
2) натрия хлорид 75,0 г;
3) маннит 10,0 г;
4) феноловый красный 0,025 г;
5) агар микробиологический 13,0 г;
6) вода дистиллированная 1000 см3.
Все компоненты растворяют в воде. Вносят 2,5 см3 1 % - ного раствора фенолового красного, устанавливают рН = 7,6 +- 0,2, кипятят 1 минуту, прибавляют замоченный заранее агар, нагревают до полного расплавления, фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Стерилизуют под давлением при температуре (121 +- 1) °С в течение 15 минут.
Хранят при температуре от 4 °С до 10 °С не более 14 суток. Допускается использовать питательную среду N 10 сухую;
г) среда Гисса с маннитом или мальтозой:
1) пептон 10,0 г;
2) натрия хлорид 5,0 г;
3) маннит или мальтоза 10,0 г;
4) феноловый красный 0,025 г;
5) агар микробиологический 13,0 г;
6) вода дистиллированная 1000 см3.
Все компоненты растворяют в воде. Вносят 2,5 см3 1 % - ного раствора фенолового красного и устанавливают рН = 7,6 +- 0. Кипятят одну минуту, прибавляют замоченный заранее агар, нагревают до полного расплавления. Фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Стерилизуют под давлением при температуре (121 +- 1) °С в течение 15 минут.
Хранят при температуре от 4 °С до 10 °С не более 14 суток.
131. Среда для контроля стерильности (тиогликолевая среда). Среду готовят в соответствии с указаниями на этикетке или по следующей прописи:
а) панкреатический гидролизат казеина 15,0 г;
б) дрожжевой экстракт 5,0 г;
в) натрия хлорид 2,5 г;
г) глюкоза 5,0 г;
д) цистин (цистеин) 0,75 г;
е) тиогликолевая кислота или тиогликолят натрия 0,5 г;
ж) раствор резазурина натрия (1:1000) 1,0 см3;
з) агар микробиологический 0,75 г;
и) вода дистиллированная 1000 см3.
Все ингредиенты растворяют в воде. Прибавляют замоченный заранее агар, нагревают до полного растворения всех компонентов, устанавливают рН = 7,2 +- 0,2, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают во флаконы. Стерилизуют при температуре (121 +- 1) °С в течение 15 минут.
Хранят при температуре от 10 °С до 25 °С в защищенном от света месте в течение 14 суток.
132. Буферный раствор. 1,0 г пептона ферментативного (или Бактофок-МК), 4,3 г хлористого натрия, 7,23 г фосфорнокислого двузамещенного натрия и 3,56 г фосфорнокислого однозамещенного калия растворяют при нагревании в 1000 см3 дистиллированной воды, фильтруют через бумажный фильтр, устанавливают рН = 7,0 и разливают в стеклянные флаконы по 400 см3.
Стерилизуют 15 минут при температуре (121 +- 1) °С.
Хранят при температуре от 4 °С до 6 °С не более 14 суток.