BAA
ОБ УТВЕРЖДЕНИИ ИНСТРУКЦИИ О ПОРЯДКЕ
ПРОВЕДЕНИЯ ФИТОГЕЛЬМИНТОЛОГИЧЕСКОЙ
КАРАНТИННОЙ ЭКСПЕРТИЗЫ РАСТИТЕЛЬНЫХ МАТЕРИАЛОВ И ПОЧВЫ
В ПРИДНЕСТРОВСКОЙ МОЛДАВСКОЙ РЕСПУБЛИКЕ
ПРИКАЗ
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОЙ ЗАЩИТЫ
ПРИДНЕСТРОВСКОЙ МОЛДАВСКОЙ РЕСПУБЛИКИ
15 июля 2008 г.
N 389
(САЗ 10-13)
В соответствии с Законом Приднестровской Молдавской Республики от 11 марта 2004 года N 395-3-III "О фитосанитарном карантине" (САЗ 04-11) с изменениями и дополнениями, внесенными законами Приднестровской Молдавской Республики от 29 ноября 2005 года N 676-ЗИД-III (САЗ 05-49), от 8 апреля 2009 года N 705-ЗИД-IV (САЗ 09-15), Законом Приднестровской Молдавской Республики от 12 марта 2004 года N 396-З-III "О защите растений" (САЗ 04-11) с изменениями и дополнениями, внесенными законами Приднестровской Молдавской Республики от 24 ноября 2004 года N 500-ЗИ-III (САЗ 04-48), от 23 декабря 2005 года N 712-ЗИД-III (САЗ 05-52), и на основании Указа Президента Приднестровской Молдавской Республики от 3 апреля 2007 года N 256 "Об утверждении Положения, структуры и штатной численности Министерства здравоохранения и социальной защиты Приднестровской Молдавской Республики" (САЗ 07-15) с изменениями и дополнениями, внесенными указами Президента Приднестровской Молдавской Республики от 18 сентября 2007 года N 612 (САЗ 07-39), от 12 января 2008 года N 25 (САЗ 08-1), от 21 мая 2008 года N 308 (САЗ 08-20), от 19 августа 2008 года N 524 (САЗ 08-33), от 30 сентября 2008 года N 636 (САЗ08-39), от 4 февраля 2009 года N 70 (САЗ 09-6), от 15 июня 2009 года N 410 (САЗ 09-25), Приказом Министерства здравоохранения и социальной защиты Приднестровской Молдавской Республики от 10 ноября 2006 года N 481 "Об утверждении Положения о Государственной службе ветеринарного и фитосанитарного благополучия Министерства здравоохранения и социальной защиты Приднестровской Молдавской Республики" (рег.N3785 от 19 января 2007 года) (САЗ 07- 4), приказываю:
1. Утвердить Инструкцию о порядке проведения фитогельминтологической карантинной экспертизы растительных материалов и почвы в Приднестровской Молдавской Республике (Приложение).
2. Направить настоящий Приказ в Министерство юстиции Приднестровской Молдавской Республики для опубликования в Собрании актов законодательства Приднестровской Молдавской Республики.
3. Контроль за исполнением настоящего Приказа возложить на начальника Государственной службы ветеринарного и фитосанитарного благополучия Министерства здравоохранения и социальной защиты Приднестровской Молдавской Республики Ткаченко В. Д.
4. Настоящий Приказ вступает в силу со дня официального опубликования.
И. ТКАЧЕНКО
МИНИСТР
г. Тирасполь
15 июля 2008 г.
N 389
Приложение
к приказу Министерства
здравоохранения и социальной защиты
Приднестровской Молдавской Республики
от 15 июля 2008 года N 389
Инструкция
о порядке проведения
фитогельминтологической карантинной экспертизы
растительных материалов и почвы
в Приднестровской Молдавской Республике 1. Общие положения.
1. Фитогельминтологическая экспертиза растительных материалов и почвы имеет целью выявление зараженности их карантинными и другими видами паразитических нематод.
2. Объектами фитогельминтологической экспертизы являются различные подземные и надземные части растений (в том числе семена), а также почва, находящаяся на подземных органах или в почвенных пробах. Фитогельминтологической экспертизе подлежит весь посадочный материал: окорененные растения, саженцы, рассада, клубни, луковицы, корневища, черенки черной смородины, а также семена риса и образцы почвы.
3. Методика фитогельминтологической экспертизы зависит от исследуемого материала. Выявление зараженности нематодами растительного материала и почвы осуществляется различными методами, которые излагаются в последующих разделах.
2. Экспертиза семян риса на выявление рисовой нематоды -
Ditylenchus angustus (Butler) Filipjev.
4. Рисовая нематода находится на внутренней стороне чешуек семян риса. Предназначенный для экспертизы образец семян риса высыпают тонким слоем на стекло или белую бумагу. По правилам отбора средних проб из него выделяют навеску в 10 - 30 грамм в зависимости от количества анализируемого материала. Если в оставшейся части образца имеются щуплые и деформированные семена, то их отбирают и присоединяют к выделенной навеске. Затем отобранные семена осторожно растирают в фарфоровой ступке до отделения чешуек риса, не допуская при этом размалывания зерен, после чего производят извлечение нематод вороночным методом, описываемым в разделе "Техника фитогельминтологического лабораторного анализа".
5. При весе навески, превышающем 15 грамм, ее разделяют на 2 равных части, каждую из которых анализируют отдельно. Если анализируемый образец состоит лишь из небольшого количества семян, то от него отбирают несколько семян, от которых отделяют покрывающие их чешуйки. На часовом стекле в воде эти чешуйки расщепляют препаровальными иглами и через 20 - 30 минут воду просматривают под бинокуляром на наличие вышедших из чешуек нематод. Если нематоды будут обнаружены, то остатки чешуек осторожно удаляют, а нематод, оставшихся в воде, тонкой энтомологической иглой переносят в каплю чистой воды на предметное стекло.
6. Дальнейшие операции по определению нематод (анестезирование, измерение и т. п.) проводят согласно рекомендациям, приведенным в разделе "Техника фитогельминтологического лабораторного анализа".
3. Экспертиза растений риса на выявление рисовой нематоды -
Ditylenchus angustus (Butler) Filipjev.
7. Растение риса просматривают макроскопически на наличие признаков заболевания. При сильном заражении на листьях и листовых влагалищах появляются коричневые полосы, стебли у верхних междоузлий бывают искривлены и тонки. Метелки иногда не выходят из влагалища листа, а если и выходят, то не развивают зерен. Нематоды скопляются в пазухах листьев. Для определения наличия нематод на растениях риса от растений, входящих в образец, отделяют особо метелки, листья и стебли. Отделенные однородные части растений расщепляют вдоль препаровальными иглами. Выделение нематод производят вороночным методом. Кроме семян и растений риса, на наличие рисовой нематоды проверяют рисовую шелуху и солому, присылаемые как упаковочный материал. Выделение нематод из них проводят тоже вороночным методом.
4. Описание рисовой нематоды-
Ditylenchus angustus (Butler) Filipjev.
8. Самка имеет длину тела 700 - 1230 микрон при ширине 15 - 22 микрон, длина пищевода 140 микрон, хвост (часть тела, расположенная за анальным отверстием) от 45 до 52 микрон. Альфа 47- 58, бета 7 - 8 и гамма 17 - 20 (альфа, бета и гамма означают отношение длины тела соответственно к ширине тела, длине пищевода и длине хвоста). Вульва расположена на расстоянии, составляющем 75 - 80% длины тела от его переднего конца.
9. Самец имеет длину тела 600 - 1100 микрон, при ширине 14 - 19 микрон; альфа 36 - 47, бета 6 - 7, гамма 18 - 23. Длина хвоста 34 - 48 микрон. Самцы снабжены парными спикулами длиной в 20 микрон, рульком и бурсой, которая сзади суживается и немного не достигает конца хвоста.
10. В семенах риса, кроме рисовой нематоды Ditylenchus angustus (Butler) Filipjev, может встречаться рисовый афеленх Aphelenchoides oryzae Yokoo. Отличить эти два вида можно только под микроскопом. Длина тела самки рисового афеленха 540 - 720 микрон при ширине 14 - 18 микрон. Голова резко отграничена от тела. Пищевод с типичным афеленхоидиым бульбусом. У самцов рулек и бурса отсутствуют. Спикулы длиной в 19 микрон, имеют серповидную форму. Задний конец тела нематоды состоит из четырех шиповидных придатков, которые можно рассмотреть только под большим увеличением микроскопа или с иммерсионной системой.
5. Экспертиза зерновых культур на выявление пшеничной нематоды
- Anguina tritici (Steinbuch) Filipjev.
11. Пшеничная нематода является вредоносной и ее наличие следует выяснить при экспертизе семян пшеницы, ячменя, ржи и полбы.
12. Предназначенный для экспертизы образец семян высыпают на стекло и просматривают под лупой все семена на выявление галл пшеничной нематоды.
13. Галлы пшеничной нематоды легко отличить по форме и величине. Они короче пшеничного зерна, имеют на одном конце заостренные отростки. Цвет галла коричневый или почти черный. В отличие от мешочков пыльной головни, легко раздавливающихся между пальцами, галлы пшеничной нематоды тверды. Для определения пшеничной нематоды галл нужно разрезать пополам, в капле воды, из него выйдет белая мучнистая масса, состоящая из множества личинок пшеничной нематоды, которые хорошо видны под микроскопом. Личинки через несколько часов начинают активно передвигаться.
6. Экспертиза рассады земляники на выявление Земляничнойн ематоды
- Aphelenchoides fragariae (Ritzema - Bos) Christie.
14. Анализу на выявление земляничной нематоды подвергают только надземные части земляники, в которых локализуется нематода. Надземные части земляники просматривают макроскопически на наличие внешних признаков заболевания, которые при сильном заражении проявляются в карликовости растений, кустистости, утолщении и укороченности стебля и цветоноса, деформации цветков, черешков и пластинок листьев.
15. От образца отбирают различные части растений (предпочтительно подозрительные на заболевание), расщепляют их вдоль препаровальными иглами и извлекают нематод вороночным методом. Части растений с явно выраженными признаками заболевания можно расщепить препаровальными иглами в воде в чашке Петри или часовом стекле и через 20 - 30 минут осадок, в котором могут находиться нематоды, вышедшие из расщепленных частей растений, просмотреть под бинокуляром. Если будут замечены нематоды, их переносят на предметное стекло в каплю воды для определения под микроскопом.
7. Описание земляничной нематоды -
Aphelenchoides fragariae (Ritzema - Bos) Christie.
16. Длина тела самки достигает 570 - 920 микрон при ширине 12 - 15 микрон. Альфа 44 - 60, бета 11 - 15, гамма 15 - 20. Вульва удалена от переднего конца тела на расстояние, равное 70% его длины. Гонада одна. Поствульварный мешок матки длинный.
17. Длина тела самца 590 - 850 микрон при ширине 12 - 15 микрон. Альфа 45 - 57, бета 11 - 12, гамма 18 - 19. Гонада одна. Длина спикулы с дорзальной стороны 21 - 23, с вентральной стороны - 10 микрон. Хвост оканчивается шипиком.
18. Следует иметь в виду, что на землянике, кроме земляничной нематоды Aphelenchoides fragariae (Ritzema - Bos), встречаются и другие паразитические нематоды, в частности стеблевая нематода Ditylenchus fragariae Kirjanova, вызывающая утолщение стебля и черешков, гофрировку листьев и т. п. , поэтому определение земляничной нематоды должно производиться обязательно под микроскопом. Стеблевая нематода земляники отличается от земляничной нематоды длиной тела, строением пищевода, кроме того, самцы снабжены парными спикулами, рульком и бурсой.
8. Экспертиза черенков черной смородины на выявление -
смородиновой нематоды - Aphelenchoides ribes (Taylor) Goodey
19. Черенки черной смородины макроскопически просматривают на наличие признаков заболевания: усохшие или мокнущие почки и метельчатые кустистые побеги.
20. Для анализа отбирают подозрительные почки растений. Эти почки расщепляют препаровальными иглами в часовом стекле в воде, которую через 30 минут просматривают на наличие нематод под бинокуляром.
21. При достаточном количестве материала выделение нематод производят вороночным методом. Выделенных нематод переносят в каплю воды, находящуюся на предметном стекле, покрывают покровным стеклом и определяют под микроскопом.
9. Краткое описание смородиновой нематоды-
Aphelenchoides ribes (Taylor) Goodey
22. Длина тела самки достигает 900 - 1120 микрон при ширине 19 - 21 микрон. Альфа 47 - 53, бета 13 - 14, гамма 18. Вульва удалена от переднего конца тола на расстояние, равное 66 - 74% его длины.
23. Длина тела самца 800 - 1000 микрон при ширине 19 - 21 микрон. Альфа 47 - 52, бета 13, гамма 18. Спикулы с дорзальной стороны длиной 22, с вентральной стороны 10 микрон.
10. Экспертиза клубней, луковиц, корнеплодов и других подземных
частей растений на картофельную нематоду - Heterodera
rostochiensis Woll.
24. Картофельная нематода встречается на клубнях картофеля, на которых она паразитирует, и в почве, приставшей к ним, а также к луковицам, корням и прочим подземным частям других растений. В соответствии с этим клубни картофеля подвергают непосредственному исследованию на картофельную нематоду, а в остальных материалах на картофельную нематоду исследуют лишь приставшую к ним почву.
25. Для выявления цист картофельной нематоды на клубнях картофеля их поверхность внимательно просматривают под лупой. Все обнаруженные в результате просмотра образования, похожие по внешнему виду на цисты картофельной нематоды, снимают препаровальной иглой, смоченной в воде, и переносят в каплю воды на предметное стекло, покрывают покровным стеклом и проверяют под бинокуляром.
26. Для проверки на зараженность картофельной нематодой почвы, приставшей к клубням картофеля и другим подземным частям растений, составляющим один образец, эта почва смывается с них водой. После того как образец будет весь обмыт, смыв небольшими порциями переносят, перемешивая, в чашку Петри и в ней с помощью лупы просматривают на наличие цист. Обнаруженные цисты или похожие на них частицы извлекают глазной пипеткой, и помещают на предметное стекло для определения под бинокуляром. В случае малого количества почвы в образце для исследования используют осадок центрифугата, полученного при фитопатологической экспертизе, которая обычно выполняется перед фитогельминтологической.
27. Если материал обмывать нельзя, то почву с него стряхивают или осторожно соскабливают на стекло или на белую бумагу и проверяют на наличие цист картофельной нематоды. При большом количестве почвы из нее выделяют для .анализа навеску весом до 100 граммов. Анализ почвы проводят одним из методов, описываемых ниже в разделе "Анализ почвы на зараженность картофельной нематодой Heterodera rostochiensis Woll".
11. Описание картофельной нематоды -
Heterodera rostochiensis Woll.
28. Самка шарообразна с вытянутым головным концом ("шейкой"), посредством которой она прикрепляется к корешку или клубню картофеля. Длина нематоды до 1 мм. Цвет сперва белый, а к осени, когда самка превращается в цисту, наполненную яйцами, постепенно переходит в бурый.
29. Самец червеобразен, длина его тела около 1 мм.
30. Кроме картофельной нематоды, в почве могут быть другие цистообразные нематоды из рода Heterodera, например, свекловичная нематода, которых нужно также определять и учитывать при экспертизе.
31. Все подземные части растений: клубни, луковицы, корни и т. п., имеющиеся в образце, подвергаются также тщательному макроскопическому просмотру на наличие признаков заболеваний, вызываемых нематодами, не относящимися к карантинным объектам.
32. Корни растений исследуют на наличие галл галловой нематоды. Галлы, имея от нескольких миллиметров до нескольких сантиметров в диаметре, хорошо видны простым глазом. При обнаружении галлов галловой нематоды на корнях растений последние разламывают и расщепляют пинцетом, препаровальными иглами в чашке Петри или на часовом стекле в небольшом количестве воды. Часть галлов удаляют со стекла, а воду просматривают на наличие нематод под бинокуляром. Удобно расщепление галла проводить под бинокуляром, так как тогда можно увидеть выпадение из ткани корня самок бутылкообразной и грушевидной формы, личинок и яйцевых мешков. Не следует галлы галловой нематоды путать с клубеньками бобовых.
33. Для выявления галловой нематоды на клубнях картофеля клубни с внешними признаками заболевания разрезают на две части. В зараженном, клубне, самки находятся в поверхностном слое толщиной в 0,5 см. С зараженных участков делают соскоб и просматривают под бинокуляром на наличие самок галловой нематоды. Для установления стеблевой нематоды картофеля на ранней стадии ее развития с клубней картофеля (преимущественно в области пуповины) осторожно снимают тонкий слой кожицы. При наличии стеблевой нематоды в мякоти клубня видны белые пятна величиной с булавочную головку - места скопления нематод. При более поздней стадии развития заболевания на клубнях картофеля из - под целой кожицы просвечивают слабые, едва заметные свинцово - серые пятна. По мере увеличения повреждения клубня кожица над пятнами разрывается, образуя трещины со светло - коричневой тканью. Если разрезать такой клубень пополам, то с поверхности клубня видна серовато - коричневая масса больной ткани, которая распространяется по поверхности клубня, не углубляясь внутрь. Скопление паразитических нематод происходит там, где здоровая часть клубня граничит с пораженной. Для анализа берут соскоб со здоровой части клубня, прилегающей к больной, и помещают в каплю воды на предметное или часовое стекло. Выделение нематод можно проводить и вороночным методом, для чего также берут кусочки клубня картофеля на границе с больной тканью. Для определения выделенных нематод переносят на предметное стекло и просматривают под микроскопом.
34. Луковицы с внешними признаками заболевания разрезают вдоль и исследуют микроскопически больную ткань для установления наличия стеблевой и других паразитических нематод. Выделение нематод производят или вороночным методом, или путем расщепления больной ткани в небольшом количестве воды. Определение нематод проводят под микроскопом.
12. Анализ почвы на зараженность картофельной нематодой -
Heterodera rostochiensis Woll.
35. Почва в образцах импортных растительных материалов независимо от того, какими культурами они представлены, должна быть проверена на наличие цист картофельной нематоды.
36. Анализ почвы проводится одним из следующих способов:
а) почву просушивают до воздушно-сухого состояния, размельчают и просевают через сито с диаметром ячеек 4,5 - 3 мм для удаления крупных частиц различных примесей. После этого отбирают образец почвы весом до 100 грамм и высыпают в литровый химический стакан или банку и заливают водой до 2/3 его объема. Содержимое сосуда тщательно размешивают стеклянной палочкой с резиновым наконечником и отстаивают 20 - 30 минут. Подсушенные цисты в это время всплывают на поверхность воды, а почвенные частицы выпадают в осадок. Образец почвы, залитый водой, нельзя оставлять на длительное время, так как цисты, пропитавшись водой, могут снова опуститься на дно сосуда. Верхний слой воды со всплывшими частицами, среди которых могут находиться и цисты картофельной нематоды, сливают на сито с ячейками размером не более 0,1 мм и промывают струей воды. Промытый осадок смывают водой с сита в сосуд; из него переливают в чашку Петри и при помощи лупы просматривают на наличие цист картофельной нематоды. Кроме того, промытый осадок с сита можно смывать не в сосуд, а на фильтр, вложенный в воронку, вставленную в стеклянную колбу, и фильтровать. Более быстрый результат получают при использовании вместо фильтра нейлоновой ткани. После фильтрования фильтр вынимают, развертывают на стеклянной пластинке и скопившийся на нем осадок просматривают под бинокуляром или лупой. Цисты, если они имеются, располагаются в узкой полоске по окружности фильтра. Замеченные цисты извлекаются препаровальной иглой;
б) почву, выделенную для анализа, помещают на металлическое сито с диаметром ячеек 1,5 - 3 мм, смоченное водой и вставленное в сито из мельничного газа с ячейками шириной 0,1 мм, и промывают под несильной струей воды при непрерывном помешивании шпателем до тех пор, пока вода, вытекающая из-под нижнего сита, не станет прозрачной. На верхнем сите остаются крупные примеси почвы, а цисты с мелкими частицами почвы оседают на сите из мельничного газа. Этот осадок сливают с сита в химический стакан, из которого все содержимое небольшими порциями при помешивании переливают в чашку Петри для просмотра. Цисты или похожие на них частицы, извлеченные из чашки Петри или с фильтра, помещают на предметное стекло в каплю воды, накрывают покровным стеклом и определяют под микроскопом или бинокуляром. Для выявления жизнеспособности цист часть их помещают в каплю воды на предметное стекло, покрывают покровным и раздавливают, легко нажимая на стекло. Яйца и личинки, выделившиеся при этом из цист, просматривают под микроскопом и устанавливают их жизнеспособность, подсчитывают особо количество жизнеспособных полных и неполных, нежизнеспособных и пустых цист.
13. Техника для фитогельминтологического
лабораторного анализа (оборудование).
37. Для проведения фитогельминтологической экспертизы необходимо иметь оптические приборы, оборудование, мелкий вспомогательный инструментарий и посуду для подготовки материала к анализу.
38. Оптические приборы состоят из микроскопа с окулярным и объективным микрометрами и препаратоводителем, бинокуля-ра, луп настольной, ручной и лобной. Из оборудования необходимо иметь сушильный шкаф, термостат и подставку для воронок.
39. Из мелких инструментов необходимо иметь: скальпель, пинцет, ножницы как обычные, так и глазные, бритвы, копье, препаровальные иглы обычные и тонкие, сделанные из самых тонких энтомологических булавок металлические сита с ячейками 1,5 - 2 и 3 мм, мельничное шелковое сито с ячейками 0,25 и 0,1 мм, фарфоровые ступки с пестиком, спиртовку, штативы для пробирок, зажим Мора, тазы, металлические сетки для воронок с ячейками 2 - 3 мм, шпатель и кисточки.
40. Из лабораторной посуды необходимо иметь: энтомологические, центрифужные и химические пробирки, стеклянные или эмалированные воронки, чашки Петри, бюксы, часовые, предметные и покровные стекла и кюветы разных размеров, химические стаканы различной емкости, кристаллизаторы, мерные цилиндры, пипетки, стеклянные палочки, капельницы, эксикаторы, чашки Коха, банки для тампонов, литровые и пол-литровые банки с притертыми пробками, фарфоровые тигельки и чашки.
14. Подготовка лабораторной посуды и инструментов к анализу.
41. Вся лабораторная посуда и все инструменты перед каждым очередным анализом должны быть совершенно чистыми. Для этого всю стеклянную и эмалированную посуду, резиновые трубки, пипетки, металлические сита и сетки необходимо промыть и затем прокипятить в воде в течение 10 минут, после этого сполоснуть чистой водой и просушить на воздухе или в сушильном шкафу при температуре 50°. Инструменты протирают 96°-ным спиртом или моют в горячей воде.
15. Выделение нематод из растительного материала.
42. Наилучшим методом выделения большинства нематод из растительного материала, особенно при слабом заражении, является вороночный метод. Для его применения достаточно иметь стеклянную или эмалированную воронку с надетой на ее конец резиновой трубкой (длиной 10 - 15 см), в нижний конец которой вставлена энтомологическая пробирка соответствующего диаметра для сбора выделенных нематод. Воронку с резиновой трубкой и с пробиркой устанавливают в вертикальном положении лучше всего в деревянном штативе со специально выпиленными для воронок отверстиями. В воронку вставляют сетку с диаметром ячеек 1 - 2 мм, лучше из тонкой металлической проволоки, чтобы задерживать мелкие части семян или растений. На сетку помещают предварительно подготовленный расщепленный анализируемый материал, После этого в воронку наливают такое количество воды, чтобы ею был покрыт весь материал, находящийся на сетке. Вода должна быть нагрета приблизительно до 30°, так как при этой температуре подвижность большинства фитонематод возрастает. Необходимо следить за тем, чтобы при наливании воды в воронку в трубке не задерживался воздух, который нужно выжать пальцами. В воронку помещают этикетку с номером экспертизы и названием материала, находящегося в ней, написанную простым карандашом. Нематоды, выходящие в воду из анализируемого материала, проваливаются в ячейки и опускаются на дно пробирки. Через 12 - 24 часа пробирку осторожно, чтобы не взболтать находящуюся в ней воду, вынимают из трубки. Верхний слой воды осторожно сливают, а оставшуюся часть (высотой 1,5-2 см) переносят при помощи пипетки на предметные или часовые стекла и просматривают под бинокуляром на присутствие нематод. Вместо пробирки на нижний конец трубки можно надеть зажим Мора. При его применении нематоды, вышедшие в воду из анализируемого материала опускаются и скопляются внутри резиновой трубки над зажимом Мора. Через 12 - 24 часа зажим открывают, часть находящегося, над ним слоя воды выпускают в подставленный бюкс или маленькую бактериологическую чашку и просматривают на наличие нематод под бинокуляром. Можно жидкость собрать в центрифужную пробирку, центрифугировать 1 минуту и затем осадок выбрать пипеткой со дна пробирки на предметное стекло для просмотра под бинокуляром. Вороночным методом можно исследовать живой, не фиксированный, материал, а также сухие растения, предварительно дав им как следует размокнуть. Вороночный метод служит для выделения личинок и только тех нематод, которые способны к активному передвижению.
43. Кроме вороночного метода, выделение нематод из растений можно проводить в различных сосудах. Расщепленное растение (или его отдельные органы) помещают в сосуд, заливают водой и оставляют на 3 - 4 часа. Нематоды, выходящие из анализируемого растения, опускаются на дно сосуда. Растение или его части удаляют пинцетом, и вода после этого отстаивается в течение 30 минут. Верхний слой воды осторожно сливают, а нижний слой с осадком (высотой 1 - 3 см) исследуют на наличие нематод.
44. Если имеются ярко выраженные признаки заболевания, то нематод легко можно обнаружить в стеблях, листьях и т. п. Для этого одну из пораженных частей растения с ярко выраженными признаками заболевания расщепляют в воде в чашке Петри или часовом стекле.
45. Через 20 - 30 минут воду просматривают на наличие нематод. Если будут обнаружены нематоды, то их переносят на предметное стекло для определения под микроскопом. Для этого рекомендуется сперва приподнять извлекаемую нематоду тонкой препаровальной иглой со дна сосуда к пленке поверхностного натяжения воды, затем иглу передвинуть под тело нематоды, быстрым движением перенести ее на конце иглы в каплю воды, находящуюся на предметном стекле, и накрыть покровным стеклом.
16. Приготовление микроскопических препаратов.
46. Временные препараты:
а) нематод лучше определять в живом виде, так как у живых нематод лучше видны все детали строения. Для этого нематод переносят в каплю воды на предметное стекло, накрывают покровным. При высыхании воды ее подливают к краям покровного стекла при помощи пипетки;
б) чтобы иметь возможность определять и измерять нематод, необходимо остановить их движение; для этого предметное стекло с нематодами нагревают с нижней стороны над небольшим пламенем спиртовой горелки в течение 5 - 6 секунд до прекращения движения нематод, но ни в коем случае не до кипения. Можно также остановить движение нематод путем прибавления под покровное стекло капли 1%-ного раствора хлоралгидрата;
в) если материал фиксированный, то нематод для определения вынимают из фиксирующей жидкости и помещают на предметное стекло в каплю воды лучше с добавкой глицерина (от 6 до 50%); сверху покрывают покровным стеклом и оставляют в этой смеси, пока нематоды не станут достаточно прозрачными (1 - 2 дня). После определения нематод их можно легко снять, отмыть от глицерина в воде и поместить снова в пробирку с фиксирующей жидкостью для хранения.
47. Постоянные препараты:
а) для изготовления постоянных препаратов применяют глицерин - желатин, который приготовляют следующим образом: 10 грамм желатина в измельченном виде помещают в колбу, заливают 60 куб. см воды и оставляют набухать в течение нескольких часов. Затем подогревают колбу с желатином, вливают в нее 40 куб. см глицерина и полученный состав нагревают до полного растворения желатина (не доводя до кипения), после этого смесь фильтруют через стеклянную вату в термостате и добавляют в нее 1 грамм карболовой кислоты;
б) глицерин - желатин разливают по пробиркам или колбочкам, которые закрывают корковыми или резиновыми пробками. Глицерин - желатин при остывании превращается в студнеобразную массу;
в) для изготовления постоянного микроскопического препарата нематод из фиксирующей жидкости переносят в каплю смеси из 3 частей 96°-ного спирта и 1 части глицерина, в которой и оставляют на несколько дней при температуре 20° до просветления нематод и полного испарения спирта. Из глицерина их переносят в глицерин-желатин. Для этого маленький кусочек глицерин - желатина помещают на предметное стекло и слегка подогревают до разжижения, после чего тонкой препаровальной иглой под бинокуляром переносят в него до 5 экземпляров нематод и накрывают покровным стеклом. После этого для равномерного распределения глицерин - желатина препарат слегка подогревают. Когда глицерин-желатин застынет, нужно очистить края покровного стекла скальпелем от его излишков;
г) для лучшей сохранности постоянных препаратов их заливают по краям покровного стекла асфальтовым лаком или канадским бальзамом. Участки препарата, в которых находятся нематоды, рекомендуется с нижней стороны предметного стекла обвести тушью. По обеим сторонам покровного стекла, на предметное стекло наклеивают этикетки. Этикетки должны быть написаны тушью. На одной этикетке указывают название растения, поврежденный орган, вид, пол нематоды и количество экземпляров. Если нематоды получены из почвы, то на этикетке соответственно отмечают тип почвы, глубину взятия пробы, вид, пол нематоды и количество экземпляров. На другой этикетке указывают номер протокола экспертизы, название страны происхождения, фамилию лица, проводившего экспертизу, и дату экспертизы.
17. Измерение нематод.
48. Для определения нематод большое значение имеют размеры частей тела и соотношения между ними. Измерения производятся при помощи окулярного микрометра. Необходимо измерять: длину тела от начала головы до конца хвоста, ширину тела в области вульвы у червеобразных самок и наибольшую ширину тела у самцов и у самок родов Heterodera и Meloidogyne, длину пищевода до основания бульбуса, длину хвоста от ануса до кончика хвоста, расстояние вульвы от головного конца (оно выражается в процентах от обшей длины тела). Этих данных достаточно для вычисления отношений альфа, бета и гамма, предложенных де-Маном:
общая длина
Альфа = -----------------------;
наибольшая ширина тела
общая длина тела Бета = ----------------;
длина пищевода
общая длина тела Гамма = -----------------.
длина хвоста 49. Кроме перечисленного, необходимо измерять длину стилета, спикул (от переднего края головки до их вершины), рулька, длину и ширину яиц, длину маточного мешка. На основе этих данных и морфологического описания производят определение нематод.
18. Пересылка, фиксация и хранение гельминтологических материалов.
50. Если собранный материал не удается определить на месте, то его нужно пересылать для определения в лабораторию. Пересылать можно живой, не фиксированный, материал, завернутый в пергаментную бумагу или в гербарном виде, причем каждый образец завертывают отдельно и снабжают этикеткой.
51. Если материал может быстро разложиться, то его пересылают в фиксированном виде. Так же в фиксированном виде пересылают материал, подозрительный на зараженность картофельной нематодой и цистами рода Heterodera .
52. Отдельно к материалу как фиксированному, так и к живому прилагают пробирки с фиксированными нематодами, выделенными из больных органов растений. Фиксирование нематод производят и при необходимости сохранить их на длительное время: для более детальных исследований.
53. В качестве фиксирующей жидкости может быть применен 4 - 5%-ный раствор формалина или 70°-ный спирт.
54. Следует учесть, что при действии фиксирующей жидкости червеобразные нематоды скручиваются и становятся неудобными для микроскопического исследования. Поэтому перед фиксацией их следует анестезировать.
55. Это достигается двумя способами: или путем нагревания, или путем прибавления анестезирующего вещества:
а) нагревание производится посредством погружения пробирки с нематодами в воду, подогретую до 50°, но не выше. Нематоды приходят в состояние теплового оцепенения и вытягиваются;
б) прибавление к воде с нематодами анестезирующего вещества хлоралгидрата в количестве, равном приблизительно 1%, в расчете на всю жидкость, содержащую нематод. Оцепенение и вытягивание нематод наступают примерно через полчаса или час. После этого в жидкость добавляют формалин с таким расчетом, чтобы крепость раствора получилась 4 - 5%.
56. Если нематод мало, то их можно собрать в небольшом количестве воды и залить 70°-ным спиртом, предварительно нагретым до кипения. Спирт рекомендуется для фиксации нематод с толстой труднопроницаемой кутикулой.
57. Хорошей фиксирующей жидкостью для нематод является смесь 70°-ного горячего спирта с 6 - 10%-ным глицерином, так как она одновременно и фиксирует и просветляет нематод, делая их готовыми к микроскопическому исследованию.
58. Если нужно сохранить отдельные органы растений с признаками заболевания, их можно тоже фиксировать в 4 - 5%-ном растворе формалина или 70°-ном спирте. Следует избегать применения спирта в том случае, если в пробе имеется много зеленых растительных остатков, так как нематоды очень сильно окрашиваются хлорофиллом, который извлекается спиртом из растений.
59. Зафиксированный материал снабжают подробной этикеткой, которая должна быть написана на плотной бумаге простым карандашом или черной тушью и вложена внутрь каждой пробирки или банки.
60. В этикетке должны быть указаны номер протокола экспертизы, название растения (русское и латинское), поврежденный орган растения, количество обнаруженных экземпляров нематод, результаты предварительного определения, страна происхождения материала, фамилия лица, проводившего экспертизу, дата экспертизы. Если нематода найдена в почве, то указывают тип почвы и на какой глубине нематода обнаружена. Размер этикетки должен быть таким, чтобы лицевую сторону можно было прочесть, не вынимая этикетки из пробирки.
61. Пробирки с нематодами или банки с пораженными органами растений наполняют фиксирующей жидкостью так, чтобы между поверхностью жидкости и пробкой оставался небольшой слой воздуха. Пробирки и банки закрывают корковыми или резиновыми пробками и заливают парафином или воском.
62. Точно так же запаковывают материал и для длительного хранения. Для этой цели можно рекомендовать хранение материалов в маленьких бутылочках с резиновой или корковой пробкой.
63. Во избежание постоянной усушки фиксирующей жидкости и необходимости периодически ее подливать, весьма целесообразно сохранять отдельные пробирки с однородным материалом в одной общей банке, в которую пробирки устанавливают вертикально, плотно друг к другу, иногда в 2 или 3 ряда (ряды перекладывают слоем ваты). Уложенный материал заливают фиксирующей жидкостью, той же, что и в пробирках. В банку вкладывают общую этикетку и герметически закупоривают.
64. Контроль за выполнением настоящей Инструкции возлагается на Государственную службу ветеринарного и фитосанитарного благополучия и иные органы государственной власти в пределах компетенции, установленной действующим законодательством Приднестровской Молдавской Республики.
65. Ответственность за нарушение настоящей Инструкции устанавливается действующими нормативными правовыми актами Приднестровской Молдавской Республики.