BAA

ОБ УТВЕРЖДЕНИИ ИНСТРУКЦИИ О ПОРЯДКЕ
ПРОВЕДЕНИЯ ФИТОПАТОЛОГИЧЕСКОЙ
КАРАНТИННОЙ ЭКСПЕРТИЗЫ РАСТИТЕЛЬНЫХ МАТЕРИАЛОВ И ПОЧВЫ
В ПРИДНЕСТРОВСКОЙ МОЛДАВСКОЙ РЕСПУБЛИКЕ

ПРИКАЗ

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОЙ ЗАЩИТЫ
ПРИДНЕСТРОВСКОЙ МОЛДАВСКОЙ РЕСПУБЛИКИ

7 июля 2008 г.
N 376

(САЗ 10-10)

В соответствии с Законом Приднестровской Молдавской Республики от 11 марта 2004 года N 395-З-III "О фитосанитарном карантине" (САЗ 04-11), с изменениями и дополнениями, внесенными Законом Приднестровской Молдавской Республики от 29 ноября 2005 года N 676-ЗИД-III (САЗ 05-49), от 8 апреля 2009 года N 705-ЗИД-IV Законом Приднестровской Молдавской Республики от 12 марта 2004 года N 396-З-III "О защите растений" (САЗ 04-11), с изменениями и дополнениями, внесенными Законом Приднестровской Молдавской Республики от 23 декабря 2005 года N 712-ЗИД-III (САЗ 05-52), и на основании Указа Президента Приднестровской Молдавской Республики от 3 апреля 2007 года N 256 "Об утверждении Положения, структуры и штатной численности Министерства здравоохранения и социальной защиты Приднестровской Молдавской Республики" (САЗ 07-15), с изменениями и дополнениями, внесенными Указами Президента Приднестровской Молдавской Республики от 18 сентября 2007 года N 612 (САЗ 07-39), и от 12 января 2008 года N 25 (САЗ 08-1), от 21 мая 2008 года N 308 (САЗ 08-20), от 19 августа 2008 года N 524 (САЗ 08-33), от 30 сентября 2008 года N 636 (САЗ08-39), от 4 февраля 2009 года N 70 (САЗ 09-6), от 15 июня 2009 года N 410 (САЗ 09-25), Приказом Министерства здравоохранения и социальной защиты Приднестровской Молдавской Республики от 10 ноября 2006 года N 481 "Об утверждении Положения о Государственной службе ветеринарного и фитосанитарного благополучия Министерства здравоохранения и социальной защиты Приднестровской Молдавской Республики", (рег.N 3785 от 19 января 2007 года) (САЗ 07-4), приказываю:

1. Утвердить Инструкцию о порядке проведения фитопатологической карантинной экспертизы растительных материалов и почвы в Приднестровской Молдавской Республике (Приложение).

2. Контроль за исполнением настоящего Приказа возложить на Начальника Государственной службы ветеринарного и фитосанитарного благополучия Министерства здравоохранения и социальной защиты Приднестровской Молдавской Республики Ткаченко В. Д.

3. Настоящий Приказ вступает в силу со дня подписания.

г. Тирасполь
7 июля 2008 г.
    N 376

Приложение
к приказу Министерства
здравоохранения и социальной защиты
Приднестровской Молдавской Республики
от 7 июля 2008 года N 376

Инструкция
о порядке проведения фитопатологической экспертизы
растительных материалов и почвы
в Приднестровской Молдавской Республике

1. Общие положения.

1. Целью карантинной фитопатологической экспертизы импортных растительных материалов является выявление не только карантинных, но и других болезней, представляющих большую или меньшую угрозу для нашего сельского хозяйства, в том числе неизвестных ранее. Поэтому при фитопатологической экспертизе растительных материалов приходится определять все обнаруженные грибы.

Подозрительные на зараженность грибами семена, клубни, луковицы и др. отбирают для определения возбудителей болезней.

2. Экспертиза семян.

2. Образец семян тонким слоем высыпают на стекло, клеенку, пластикат или лист белой бумаги и просматривают под лупой.

Удобно пользоваться для этой цели бинокулярной лобной лупой. Семена с плодоношениями грибов (подушечками, пикнидами, перитециями др.) отбирают для микроскопического исследования и определения обнаруженного возбудителя болезни.

3. Щуплые, деформированные, подозрительные на внутреннюю инфекцию семена, не имеющие явных внешних признаков заражения, отбирают и закладывают во влажную камеру, чтобы получить плодоношение гриба.

4. Если в условиях влажной камеры плодоношение гриба не образуется, а появляется только мицелий, последний пересевают на питательную среду, чтобы получить чистую культуру и после этого приступают к определению гриба.

5. Методы выделения грибов из семян и других растительных материалов, а также рецепты наиболее часто употребляемых сред даются в главе "Техника фитопатологического лабораторного анализа".

    3. Анализ семян кукурузы на выявление сухой гнили (диплодиоза).

6. В образце семян кукурузы, поступившем на экспертизу, просматривают все семена.

Поверхность пораженных диплодиозом семян лишена блеска, семена имеют сероватый или буровато - коричневый оттенок, особенно в зародышевой части. Чем сильнее они поражены, тем яснее заметна измененная окраска зародыша. Белый мицелий на поверхности семян, даже при сильном их заражении, наблюдается очень редко.

7. Пикниды Diplodia zeae в виде черных точек чаще всего образуются на зародыше, поэтому особенно внимательно надо просматривать именно эту часть семян. Так как пикниды Diplodia zeae иногда появляются на семенах кукурузы, совершенно здоровых по внешнему виду, то просматривают семена не только с признаками сухой гнили, но и здоровые на вид.

8. При наличии пикнид на семенах производят их микроскопическое исследование и определяют возбудителя болезни. На этом и заканчивается анализ образца.

Если пикнид не обнаружено, семена с признаками сухой гнили, а также щуплые, легковесные и с другими дефектами, как подозрительные на скрытую зараженность диплодиозом закладывают (не менее 100 семян от каждого образца) во влажную камеру. Если такого количества семян нет, то помещают во влажную камеру все отобранные от образца семена.

9. Семена закладывают в чашки Петри, которые предварительно стерилизуют сухим жаром в течение 2 часов при 100°С вместе с уложенными на их дно двумя - тремя кружками фильтровальной бумаги. После стерилизации бумагу в чашках увлажняют стерильной водой. Семена раскладывают по 7-10 штук в каждую чашку и помещают в термостат при 24 - 25°С.

До закладки подозрительных на диплодиоз семян в чашки Петри их 3-5 секунд обеззараживают от поверхностной микрофлоры в растворе сулемы 1:1000, после чего промывают стерильной водой.

Если сулемы нет, можно использовать 1% - ный раствор марганцовокислого калия, затем промыть семена стерильной водой или погрузить их на 1-2 минуты в 96%-ный спирт с последующей просушкой между 2 листами стерилизованной фильтровальной бумаги.

10. Для дезинфекции семян применяют и метод фламбирования, т.е. каждое зерно берут пинцетом и быстро проводят через пламя горелки, после чего тут же помещают во влажную камеру.

11. На 5 - 6 день семена, пораженные диплодиозом, покрываются белым мицелием Diplodia zeae. Но иногда наблюдают на семенах мицелий гриба Fusarium moniliforme, который в массе отличается розоватым или темно - красновато - малиновым оттенком.

12. На 9 - 10-й, а иногда на 15 - 20-й день на семенах появляются пикниды, которые исследуют микроскопически.

13. Чтобы получить чистую культуру Diplodia zeae, появившийся на семенах мицелий, подозрительный на диплодиозный, пересевают в пробирки на стерилизованные здоровые семена кукурузы, которые подготавливают следующим образом. Три грамма семян кукурузы заливают в пробирке 2 мл воды. Пробирки стерилизуют текучим паром в аппарате Коха два дня подряд по 1 часу в день или в кипящей воде при этих же условиях.

При посеве мицелия Diplodia zeae на семена кукурузы уже на 8-й день образуются пикниды.

    4. Описание Diplodia zeae (Schw.) Lev.

14. Пикниды - темные, поверхностные или погруженные в ткань; в последнем случае на поверхность выходит округлое сосковидное устьице. Форма пикнид округлая или грушевидная, слегка сплющенная.

15. Споры - светло - коричневые, цилиндрические, булавовидные, редко эллипсоидальные, прямые или изогнутые, с тупыми концами, с 1 - 3 перегородками. Размер спор 13 - 33 х 3 - 7 микронов.

16. В СНГ сухая гниль кукурузы имеет распространение, где возбудителем болезни является один вид гриба, а именно Diplodia zeae. В США, кроме Diplodia zeae, на кукурузе встречаются еще два вида грибов этого же рода: Diplodia macrospora Farl. и Diplodia frumenti Ell. et Ev.

17. При заражении кукурузы D. macrospora внешние признаки болезни те же, что и вызываемые D. zeae, поэтому определить гриб можно только при микроскопическом исследовании пикнид и спор.

18. Заражение кукурузы D. frumenti отличается по ряду внешних признаков от D. zeae и D. macrospora. На пораженных D. frumenti початках и семенах появляется характерное почернение, которое бывает вызвано темно - коричневым мицелием гриба, а также потемнением зараженных тканей. Больные семена внутри также бывают окрашены в черный цвет и мумифицированы в результате сильного развития грибницы и обильного образования пикнид.

19. Морфологические различия видов рода Diplodia, встречающихся на кукурузе, следующие:

---------------------------------------------------------------------------------------------
| Вид гриба  | Цвет       | Форма спор        | Число  | Цвет зрелых |   Размер спор (в     |
|            | мицелия    |                   | клеток | спор        |      микронах)       |
|            |            |                   | в      |             |----------------------|
|            |            |                   | споре  |             | средний | предельный |
|------------|------------|-------------------|--------|-------------|---------|------------|
|            |            | Цилиндрические    |        |             |         |            |
|            |            | или булавовидные, |        | Светло-     |         |            |
| D.zeae     | Белый      | слегка изогнутые  |  1-3   | коричневый  |   23,8x |  13-33x    |
|            |            | или прямые        |        |             |    5,3  |   3-7      |
|------------|------------|-------------------|--------|-------------|---------|------------|
|            |            | Цилиндрические    |        |             |         |            |
| D.         |            | или булавовидные, |        | Светло-     |   67,8x |  43-95x    |
| macrospore | Белый      | слегка изогнутые  |  1-4   | коричневый  |    9,0  |  6-13      |
|            |            | или прямые        |        |             |         |            |
|------------|------------|-------------------|--------|-------------|---------|------------|
|            | Бурый или  |                   |        |             |         |            |
|            | темно-     | Эллипсоидальные   |        | Темно-      |   25,3x |  19-31x    |
| D.frumenti | коричневый |                   |  1-2   | коричневый  |   13,9  |  11-15     |
---------------------------------------------------------------------------------------------

5. Анализ семян льна на выявление "пасмо" -
Septoria linicola (Speg.) Garas.

20. В образце, поступившем на анализ, просматривают все семена. Особое внимание обращают на щуплые, более светлой окраски, матовые семена. Иногда на поверхности таких семян, но чаще в зародышевой части могут быть пикниды гриба.

21. Кроме семян, тщательно просматривают имеющийся мертвый сор (обломки стеблей льна, листьев, коробочек и др.), чтобы установить, находятся ли на нем пикниды Septoria linicola. Практика показывает, что при просмотре именно мертвого сора чаще и выявляется зараженность образцов "пасмо" льна, т. к. на самих семенах пикниды Septoria linicola обнаруживаются очень редко. Принадлежность пикнид к Septoria linicola устанавливают микроскопическим исследованием.

22. При отсутствии явных признаков заражения семена льна анализируют методом центрифугирования. Для этого семена, отобранные от образца по методу взятия средней пробы, насыпают в обычную химическую пробирку до 1/3 ее объема, наливают воду в таком количестве, чтобы семена с водой занимали 2/3 пробирки. Затем пробирку тщательно взбалтывают, но не более одной минуты, чтобы избежать ослизнения семян.

23. Сразу же после взбалтывания воду быстро сливают в центрифужные пробирки и центрифугируют в течение 5 минут. После центрифугирования осторожно сливают воду из пробирок, оставляя на дне осадок и около 1 мл воды. Осадок взмучивают встряхиванием пробирки и приготовляют из него микропрепараты, которые просматривают под микроскопом, чтобы обнаружить споры Septoria linicola. Из осадка одной центрифужной пробирки приготовляют десять препаратов. Просмотр, микропрепаратов следует вести при большом увеличении микроскопа, т. е. при окуляре 15х и объективе 40.

24. При отсутствии спор Septoria linicola в центрифугате производят анализ семян путем посева их на питательную среду в чашки Петри, которые предварительно должны быть простерилизованы. Перед посевом поверхность семян дезинфицируют спиртом, после чего их просушивают между листами стерильной фильтровальной бумаги.

25. От просматриваемого образца высевают не менее 100 щуплых, более светлоокрашенных семян с шероховатой поверхностью. В каждую чашку Петри закладывают не более 20 семян. Чашки Петри с заложенными в них семенами помещают в термостат с температурой 21-25°С, при появлении колоний гриба в чашках Петри делают пересев из этих колоний в пробирки с той же средой. Микроскопический анализ гриба в чашках Петри и в пробирках проводят на 8 - 10 день после посева.

Лучшей средой для роста гриба является двухпроцентный картофельно-глюкозный агар (рецепт среды дается в разделе "Техника фитопатологического лабораторного анализа"). На этой среде Septoria linicola образует мелкие приподнятые колонии с редким белым или сероватым мицелием и оранжевыми слизистыми каплями выделяющихся спор.

6. Описание Septoria linicoia (Speg.) Garas.

26. Пикниды - черные, чечевицеобразной формы, иногда имеют не вполне сформированную оболочку. Развиваются под эпидермисом. Размер пикнид 75 - 100 микронов в диаметре.

27. Споры - бесцветные, цилиндрические, почти нитевидные, прямые или слегка изогнутые, обычно с 3 перегородками, размер спор 20 - 30 х 1,5 - 3 микрона.

7. Анализ семян пшеницы, риса и ячменя на выявление видов головни:
индийской головни пшеницы - Tilletia (Neovossia) indica Mitra,
головни риса - Tilletia (Neovossia) horrida Tak.
и головниячменя - Tilletia Pancicii Bub. et Ran.

28. В образцах, поступивших на анализ, просматривают под лупой все семена на наличие головневых зерен, которые характеризуются следующими признаками:

а) индийская головня пшеницы - семена поражаются головней не полностью, а частично. Наиболее часто заболевание проявляется в зародышевой части, зерна, где пораженные участки напоминают пустулы ржавчины. Споры часто скапливаются в бороздке зерна в виде черной массы;

б) головня риса - головневые семена риса более щуплые по сравнению со здоровыми. В большинстве случаев, не раздавив семени, трудно обнаружить головневые зерна, так как кроющие чешуи хорошо сохраняются и споровая масса через них не просвечивает. Очень редко, когда чешуи бывают раздвинуты, обнаруживается черная масса спор;

в) мокрая головня ячменя - семена ячменя, пораженные мокрой головней, обычно имеют более темную оболочку и целиком заполнены темно-коричневой споровой массой. Они несколько короче и толще, чем здоровые семена. Если при просмотре семян головневые зерна не будут обнаружены, то прибегают к анализу образца методом центрифугирования.

29. От анализируемого образца семян (пшеница, рис или ячмень) в зависимости от его веса по методу взятия средних проб берут навеску от 5 до 25 граммов.

30. Взятую навеску семян высыпают в колбу Эрленмейера или в химический стакан и заливают на 30 минут водой, нагретой до 30 - 35°С. Воды наливают такое количество, чтобы ее уровень был выше уровня семян на 1,5 - 2 сантиметра. Через 30 минут колбу с семенами взбалтывают в течение 5 минут, после чего воду быстро сливают в центрифужные пробирки и центрифугируют в течение 5 минут. После центрифугирования осторожно сливают воду из пробирок, оставляя образовавшийся на дне осадок и 1,5 мл воды. Осадок взмучивают встряхиванием пробирки. Стеклянной палочкой берут каплю взмученного осадка и наносят ее на предметное стекло. Каплю покрывают покровным стеклом, и подготовленный таким образом препарат просматривают под микроскопом при малом увеличении, т. е. при окуляре 15х и объективе 8, на наличие спор головни. Из осадка каждой пробирки приготовляют для просмотра пять микропрепаратов.

7. Описание спор головни пшеницы, риса и ячменя.

31. Tilletia (Neovossia) indica Mitra - индийская головня пшеницы. Споры коричневого цвета, в массе черные, шаровидные или овальные, сетчатые, размером 22 - 42 х 25 - 40 микронов. Отдельные споры достигают 55 микронов .

32. Tilletia (Neovossia) horrida Таk. - головня риса. Споры в массе черного цвета. Отдельные споры шаровидные или округлые, реже широко эллипсоидальные, размером 21,7 - 31 х 26 - 35 микронов, молодые светло - или темно - коричневые, зрелые - матово - черные, непрозрачные, с заостренными выступами. Tilletia Pancicii Bub. Et Ran. - мокрая головня ячменя. Споры в массе темно - буро-фиолетовые. Отдельные споры желтоватые или фиолетово - коричневые, шаровидные, яйцевидные или эллипсоидальные, размером 20 - 28 х 18 - 24 микрона, сетчатые, с петлями 2 - 6 микронов ширины и выступами в 2 - 3,2 микрона высоты.

8. Анализ семян на выявление южной склероциальной гнили -
Sclerotium Rolfsii Sacc.

33. Семена всех субтропических культур и арахиса просматривают под лупой на наличие мицелия и склероциев.

34. При анализе арахиса, который чаще других культур оказывается пораженным южной склероциальной гнилью, особенно тщательно просматривают внутреннюю поверхность створок у загнивающих бобов, чтобы выявить веерообразно стелющийся мицелий и склероции. Если обнаружен только мицелий, его просматривают на наличие пряжек, которые характерны для мицелия Sclerotium Rolfsii. Если мицелий и склероции отсутствуют, то подозрительные семена и оболочки плодов закладывают во влажную камеру в стерилизованные чашки Петри, которые ставят в термостат при температуре 25 - 28°С. На 4 - 5-й день появляется мицелий, на котором дней через 10 образуются многочисленные склероции. Чтобы избежать развития сапрофитных грибов, рекомендуется пересевать мицелий, появившийся на семенах, заложенных в чашки, на стерилизованные ломтики картофеля, на которых происходит массовое образование склероциев на 5- 10 - й день.

9. Описание Sclerotium Rolfsii Sacc.

35. Склероции - по форме, размерам и цвету напоминают семена крестоцветных культур. Они мелкие, 1-3 мм в диаметре, округлые. Окраска склероциев в зависимости от степени их зрелости колеблется от светло - желтой до темно - коричневой, но никогда не бывает черной.

36. Мицелий - бесцветный, лучисто - расходящийся по субстрату, с хорошо выраженными перегородками, около которых образуются пряжки. Наличие пряжек на мицелии является одним из основных диагностических признаков этого гриба. Гифы гриба, толщиной 2 - 9 микронов, тесно срастаются друг с другом и дают тяжи или пленки.

10. Экспертиза клубней, луковиц и других подземных частей
растений.

37. Все клубни, луковицы и другие подземные части растений, составляющие образец, просматривают макроскопически. При этом из них отбирают экземпляры, подозрительные на заболевания или явно зараженные, для определения возбудителя болезни. При просмотре клубней картофеля особое внимание обращают на глазки, где могут быть выявлены наросты рака картофеля.

38. Почву, имеющуюся на поверхности подземных частей растений, независимо от того, из какой страны они поступили, проверяют на наличие зимних спорангиев возбудителя рака картофеля. Если на подземных частях растений имеются только следы почвы, то анализ ее проводится следующим образом.

39. Клубни, луковицы и другие части растений, составляющие образец, обмывают в чашке Коха или кристаллизаторе в небольшом количестве воды (250 - 500 мл). Воду по мере обмывания в ней клубней или лукавиц постепенно доводят до указанного объема.

40. После того как образец будет весь обмыт, воду сливают в химический стакан и дают ей отстояться 3 - 5 минут. Затем пипеткой из стакана берут 4 - 5 мл жидкости так, чтобы захватить немного осадка, сливают ее в центрифужную пробирку и центрифугируют в течение 5 минут. От каждого анализируемого образца подготовляют для центрифугирования по 4 пробирки.

41. После центрифугирования осторожно сливают воду из каждой пробирки до осадка, который взмучивают встряхиванием пробирки. Стеклянной палочкой берут каплю взмученного осадка на предметное стекло, покрывают ее покровным стеклом и приготовленный микропрепарат просматривают под малым увеличением микроскопа, т. е. при окуляре 15х и объективе 8, на наличие зимних спорангиев возбудителя рака картофеля.

42. Из осадка каждой центрифужной пробирки приготовляют для просмотра по пять микропрепаратов. Если, на подземных частях растений почва имеется в сравнительно большом количестве, то анализ ее проводится одним из методов, приведенных далее.

11. Описание зимних спорангиев Synchytrium endobioticum
(Schilb.) Perc.

43. Зимние спорангии имеют форму округлых тел желтовато-коричневого цвета с зернистым содержанием. Они покрыты оболочкой, состоящей из трех слоев, из которых наружный является остатками отмерших клеток хозяина и часто имеет от одного до нескольких выростов различной формы. Оболочка окрашена в довольно яркий светло-бурый цвет и служит хорошим отличительным признаком, позволяющим легко обнаруживать спорангии как в ткани растения, так и в почве. Размер их 50 - 80 микронов.

12. Экспертиза живых растений.

44. Саженцы и черенки всех культур просматривают макроскопически на наличие признаков заболевания (пятнистость, язвочки, наплывы, раковые образования). Экземпляры с такими признаками отбирают для определения возбудителя болезни. Если невозможно выявить и определить возбудителя болезни обычным микроскопированием пораженных частей растений проводят дополнительное исследование, применяя влажную камеру или посев на питательную среду.

45. Посадочный материал цитрусовых и косточковых культур на вирусные болезни не анализируют, черенки и саженцы этих культур направляют в карантинные питомники.

13. Анализ саженцев и черенков лимонана выявление "мальсекко"-
Deuterophoma tracheiphila Petri.

46. Саженцы и черенки лимона тщательно просматривают под лупой, т. к. при заражении их "мальсекко" на торцах этих черенков находятся расположенные группами многочисленные пикниды. Древесина зараженного лимона обычно бывает окрашена в различные оттенки красноватого или желтовато-оранжевого цвета, это особенно хорошо видно на косом поперечном срезе. В зависимости от степени заражения пигментация иногда охватывает всю поверхность или часть торца, иногда же бывает в виде отдельных разбросанных пятен.

47. Применением 1%-ного раствора едкой щелочи (КОН, NaOH), наносимой кисточкой на поверхность среза черенка или саженца, можно усилить типичную для "мальсекко" окраску древесины и выявить ее в образцах, где имеется внутренняя инфекция. Быстрота появления пигментации от действия едкой щелочи не всегда бывает одинакова, что зависит от месторасположения пигмента в исследуемом образце. Если пигмент сосредоточен во внешних слоях древесины, пигментация выявляется мгновенно; если в лежащих глубже слоях, то появление ее несколько задерживается.

48. При изготовлении водных растворов едких щелочей необходимо соблюдать следующие меры предосторожности: едкий натрий или калий брать пинцетом или шпателем, но не руками. Если при взвешивании приходится раскалывать кристаллы щелочи, то надо надевать предохранительные очки, чтобы частицы щелочи не попадали в глаза.

14. Описание Deuterophoma tracheiphila Petri.

49. Пикниды - многочисленные черные, грушевидные или шаровидные, расположенные на черенках и листовых прикреплениях. Размер пикнид 50 - 150 микронов.

50. Споры - палочковидные или слегка овальные, бесцветные, одноклеточные, 2,8 - 4,2 х 1,0 - 1,5 микрона. Выходят из пикниды через сосочкообразное отверстие в виде ленты, образующей петли и на конце расширенной.

51. Грибница - в основном бесцветная, отдельные участки гиф красновато-оранжевого цвета.

15. Анализ саженцев на выявление техасской корневой гнили -
Phymatotrichum omnivorum (Shear) Duggar (Ozonium
omnivorum Shear ).

52. У растений осматривают под 15 - 20 - кратной лупой корневую шейку и корни на выявление гиф, тяжей и склероциев Ph. omnivorum, при обнаружении которых проводят микроскопический анализ для определения этого гриба. Корни растений просматривают на наличие охряно - желтых пятен, которые являются характерными для данного заболевания.

53. Если на корнях растений имеется почва, ее анализируют на присутствие склероциев. Для просмотра берут почву из мест, прилегающих к подземным частям растений. В зависимости от количества имеющейся почвы с каждого растения для анализа берется 2 - 5 проб по 20 - 50 г каждая. Почву предварительно доводят до воздушно - сухого состояния и просевают через сито с отверстиями диаметром 0,25 мм. Оставшуюся на сите почву просматривают на наличие склероциев под бинокуляром.

16. Описание Phymatotrichum omnivorum (Ozonium omnivorum).

54. В цикле развития гриба могут быть отмечены 3 стадии: На корневой шейке и корнях растений встречаются первая и последняя стадии.

55. Мицелиальная стадия гриба бывает трех типов:

а) мицелий крупноклеточный, состоит из крупных бесцветных зернистых клеток, этот тип мицелия часто образует значительное число боковых выступов;

б) мицелий состоит из нескольких многоклеточных гиф, собранных вместе и образующих так называемые тяжи. Центральная гифа всегда толще остальных гиф, окружающих ее. Тяжи вначале бесцветные, но со временем они становятся рыжевато - коричневыми, а иногда красновато-коричневыми;

в) мицелий игольчатый имеет паутинистый вид и представляет собой разветвленные под прямым углом гифы.

56. Конидиальная стадия при экспертизе растительного материала не обнаруживается, так как она образуется на поверхности почвы на некотором расстоянии от пораженных растений.

57. Склероциальная стадия - склероции мелкие, темные, размером 1 - 2, округлые или веретеновидной формы, одиночные. Встречаются склероции, расположенные цепочкой или собранные в клубочки.

При разрезе склероция видны псевдопаренхиматические слои ткани темно-коричневой окраски с наружной стороны и светлой - с внутренней.

17. Анализ саженцев на выявление южной склероциальной гнили -
Sclerotium Rolfsii Sacc.

58. Саженцы всех культур проверяют на зараженность южной склероциальной гнилью. Корневая шейка и корни всех растений, имеющихся в образце, представленном на анализ, просматривают под 15 - 20 - кратной лупой на наличие мицелия и склероциев. На пораженных южной склероциальной гнилью частях растений побуревшая ткань покрыта хорошо заметными тяжами мицелия, состоящими из тонких белых гиф, на которых часто образуются склероции.

59. Если же мицелия или склероциев при просмотре не выявлено, но обнаружено загнивание корневой шейки или корней, то с них срезают кусочки пораженной ткани и закладывают во влажную камеру. При заражении южной склероциальной гнилью на 3-5-й день во влажной камере на заложенном материале появляется мицелий и на 8-10-й день образуются склероции.

60. Почву, если она имеется на растениях, просматривают на наличие склероциев. Для анализа используют почву с корневой шейки и корней. В зависимости от количества почвы с каждого растения берут 2 - 5 проб по 20 - 50 г каждая. Почву предварительно доводят до воздушно - сухого состояния и просевают через сито с ячейками диаметром 0,25 миллиметра.

61. Оставшуюся на сите почву просматривают на наличие склероциев под бинокуляром. Если склероции не будут обнаружены в почве, тогда ее пересыпают опять в сито и ставят под струю воды, чтобы отмыть илистые частицы.

62. После промывки почву помещают в химический стакан, под который подкладывают лист белой бумаги, и заливают водой. Часть склероциев, если они имелись в почве, всплывает на поверхность воды, часть остается на дне, но они хорошо бывают видны на белом фоне. Подобным же образом анализируют почву на луковицах и на других подземных частях растений. Описание гриба Sclerotium Rolfsii Sacc. приведено в разделе "Анализ семян на выявление южной склероциальной гнили".

18. Экспертиза почвы на зараженность возбудителем рака
картофеля.

63. При наличии почвы в образцах импортного растительного материала независимо от того, какими культурами они представлены, проверяют, нет ли в ней зимних спорангиев возбудителя рака картофеля.

64. Для анализа почвы рекомендуются четыре метода.

65. Метод Г. Н. Дорогина пригоден для анализа любого типа почв:

а) при количестве почвы в образце до 20 г ее анализируют как одну пробу. Если почвы имеется 20 - 100 г, ее хорошо перемешивают, делят на две части и каждую анализируют отдельно. Когда почвы в образце больше 1 кг, то берут среднюю пробу в 1 кг, делят ее на 6 - 7 частей, которые анализируют отдельно;

б) каждую анализируемую пробу почвы просевают через сито с ячейками 5 мм. Остаток почвы на сите после просевания просматривают, чтобы установить, имеются ли в ней кусочки раковых наростов;

в) просеянную часть почвы помещают в химический стакан и взбалтывают в течение 2 - 3 минут в 250 мл воды, после чего оставляют на 1 минуту для оседания крупных частиц почвы. Через минуту воду со взмученными в ней мелкими частицами почвы сливают в химический стакан и оставляют для отстаивания осадка на 30 минут. Затем пипеткой берут 20 мл воды над осадком, но так, чтобы захватить немного осадка, разливают ее в 4 центрифужные пробирки и центрифугируют в течение 5 минут;

г) после центрифугирования воду из пробирок осторожно сливают, оставляя осадок и 1-1,5 мл воды. Осадок взмучивают встряхиванием пробирки. Стеклянной палочкой берут каплю взмученного осадка и наносят на предметное стекло. Приготовленный микропрепарат просматривают под малым увеличением микроскопа (окуляр 15х, объектив 8) на наличие зимних спорангиев возбудителя рака картофеля;

е) из осадка каждой центрифужной пробирки приготовляют для просмотра по пять препаратов.

66. Метод К. Е. Шарикова:

а) почву, предназначенную для анализа, доводят до воздушно - сухого состояния. От каждого образца берут среднюю пробу почвы. Для этого образец воздушно - сухой почвы, предварительно размельченной и просеянной через сито с отверстиями в 1 мм, высыпают на лист бумаги, клеенку или пластикат, разравнивают тонким слоем (не более 0,5 см) и делят на небольшие квадратики, примерно 3х3 см. Из каждого квадрата ложечкой или шпателем берут немного почвы, стараясь по возможности захватить всю толщину слоя. От средней пробы, которая должна быть хорошо перемешана, берут навеску почвы в 2 - 5 г, растирают в фарфоровой ступке пестиком (лучше резиновым) и просевают через мельничный газ или сито с отверстиями 0,25 мм. Спорангии легко проходят через такое сито, а крупные частицы почвы задерживаются. Можно почву просевать и через двойные марлевые мешочки, которые используются только для одного образца, после чего сжигаются;

б) после высыпания почвы из ступки на сито стенки ступки очищают мягкой кисточкой. Просевать почву лучше на лист глянцевой бумаги или на целлулоидную пленку. Целлулоидная пленка удобна тем, что с нее легко стряхивается почва и спорангии к ней почти не прилипают;

в) просеянную почву ссыпают в пробирку для центрифугирования и туда же наливают 3 - 4 мл четыреххлористого углерода (можно заменить дихлорэтаном). Пробирку закрывают корковой пробкой и жидкость тщательно взбалтывают в течение 1 - 2 минут, а затем центрифугируют не более 2 минут при медленном вращении центрифуги. После центрифугирования на дне пробирки оказывается осадок почвы, а на поверхности жидкости или во взвешенном в ней состоянии - спорангии с небольшим количеством органических примесей. Жидкость с находящимися в ней спорангиями сливают на часовое стекло для испарения. После испарения четыреххлористого углерода (или дихлорэтана), что происходит за 3 - 4 часа при комнатной температуре (при подогревании в сушильном шкафу за 15 - 20 минут), на часовом стекле остается легкий осадок, в который добавляют несколько капель воды или машинного масла, или глицерина, разбавленного водой, и просматривают под микроскопом при окуляре 15х и объективе 8;

г) просматривать осадок на часовом стекле лучше в машинном масле или глицерине, чем в воде: обе эти жидкости несколько просветляют спорангии, что позволяет легче найти их под микроскопом. Благодаря вогнутой форме часового стекла спорангии стягиваются к центру углубления и поэтому легко могут быть обнаружены. Когда спорангиев на часовом стекле обнаруживается немного (не более 10), то их легко здесь же подсчитать. При большом количестве спорангиев на часовом стекле сосчитать их трудно. Если необходимо произвести точный учет спорангиев в пробе, то нужно весь осадок с часового стекла перенести на предметное стекло (иногда для этого нужно сделать несколько препаратов) и сосчитать их, передвигая препарат под микроскопом с помощью препаратоводителя. Осадок с часового стекла на предметное переносят глазной пипеткой вместе с несколькими каплями жидкости;

д) просмотр и подсчет спорангиев лучше всего производить при окуляре 15х и объективе 8. Препарат удобнее водить поперек предметного стекла, просматривая одно поле зрения за другим, а затем, дойдя до конца, переходить на другой ряд;

е) часовое стекло после переноса с него осадка просматривают под микроскопом. Оставшиеся на нем единичные спорангии просчитывают и прибавляют к общему количеству;

ж) при подсчете спорангиев нормальные, деформированные и пустые учитываются отдельно;

з) метод анализа почвы по Шарикову разработан для легких супесчаных почв, но его можно применять и для анализа черноземных почв. В черноземных почвах спорангии сильно адсорбируют гумус и поэтому окрашиваются в черный цвет, что очень затрудняет их обнаружение при анализе почвенных проб. Чтобы избежать этого, применяют обесцвечивающие вещества, такие, как 3%-ный раствор перекиси водорода или крепкий этиловый спирт, слегка подкисленный соляной кислотой. Обесцвечивание наступает неодинаково быстро - от нескольких минут до нескольких часов. Более высокие концентрации перекиси водорода быстрее обесцвечивают спорангии, но они могут разрушать их оболочки.

67. Метод Н. Н. Владимирской (пленочный метод) разработан для анализа легких супесчаных почв:

а) почвенные образцы, предназначенные для анализа, доводят до воздушно - сухого состояния. Почва каждого образца после высушивания хорошо перемешивается и просевается через сита с отверстиями 3 мм. Просеянную почву тщательно растирают в фарфоровой ступке резиновым пестиком;

б) от всего анализируемого образца почвы берут в зависимости от его размера от одной до нескольких средних навесок по 5 г каждая. Каждая навеска просевается вторично через сито с отверстиями 0,25 мм, высыпается в выпаривательную чашку диаметром 6 - 7 см и заливается дихлорэтаном (можно пользоваться четыреххлористым углеродом). Жидкости для заливки почвы берется в 2 - 3 раза больше объема взятой почвы;

в) спорангии обладают большой прилипаемостью, поэтому посуду, в которой почву растирают и просевают, необходимо тщательно обметать мягкой кисточкой или перышком, стряхивая с них почву в выпаривательную чашку;

г) после заливки почвы дихлорэтаном на поверхности жидкости сразу же появляется, чаще всего в центре чашки, пленка в виде тонкого налета (слабой мути). Эта пленка состоит из скопления поднявшихся на поверхность жидкости тонких минеральных и растительных частиц и спорангиев, если они имелись в почве. Пленку следует собирать сразу же, как только она появится, не допуская ее оседания на стенках чашки. Поэтому до заливания почвы дихлорэтаном необходимо подготовить предметное стекло с каплей воды и чистое сухое покровное стекло;

д) снимают пленку уголком или ребром покровного стекла, которым покрывают каплю воды на предметном стекле. Полученный препарат кипятят на пламени спиртовки, охлаждают, добавляют воду, если ее недостаточно в препарате, и просматривают под микроскопом. Кипячение препарата удаляет пузырьки воздуха со спорангиев, разбивает комочки склеившихся спорангиев. Практика показала, что при приготовлении препарата снятую пленку лучше помещать не в каплю воды, а в каплю машинного масла. Это дает возможность избегать кипячения препарата, которое нежелательно тем, что при нем возможно разбрызгивание воды из-под покровного стекла, вместе с которой могут быть выброшены и спорангии. Машинное масло хорошо просветляет спорангии, что значительно облегчает их нахождение в препарате;

е) приготовленные препараты просматривают при малом увеличении (окуляр 15х, объектив 8) и при большом увеличении (окуляр 15х, объектив 40). При обнаружении спорангиев почва считается зараженной. Если требуется установить степень зараженности почвы, тогда ведут подсчет спорангиев, для чего тщательно собирают всю пленку, чтобы приготовить 2 - 3 препарата.

68. Метод А. Г. Николаева разработан для анализа легких и тяжелых почв:

а) от анализируемого образца почвы берется средняя проба весом 20 - 25 г, которую доводят до воздушно - сухого состояния, растирают в фарфоровой ступке резиновым пестиком и просевают через сито с отверстиями 0,1 - 0,2 мм. Просеянную почву анализируют на присутствие спорангиев. Для извлечения спорангиев из почвы пользуются следующими органическими жидкостями или водными растворами минеральных солей с удельным весом 1,36 - 1,45:

1) органические жидкости - четыреххлористый углерод;

2) смесь четыреххлористого углерода и эфира;

3) смесь дихлорэтана и четыреххлористого углерода;

4) хлороформ. Можно также пользоваться и чистым дихлорэтаном; Водные растворы минеральных солей:

1) хлористый кальций 40%-ный;

2) азотнокислый кальций 45%-ный. Для тяжелых почв рекомендуются органические жидкости. Растворы минеральных солей применяют при анализе супесчаных почв.

б) анализ почвы ведут в приборе, состоящем из обычной пробирки для отсасывания и делительной воронки, укрепленных на штативе и соединенных между собой резиновой трубкой. Делительная воронка устанавливается так, чтобы уровень содержащейся в ней жидкости находился выше верхнего края пробирки. В делительную воронку наливают одну из перечисленных жидкостей. В пробирку насыпают 2 г просеянной почвы (если анализируют почву без просевания, навеску увеличивают до 3 - 5 г ), а затем, открыв кран делительной воронки, впускают в пробирку жидкость до 3/4 объема пробирки. Закрыв кран воронки, хорошо размешивают почву в пробирке стеклянной палочкой и отстаивают 5 - 10 минут для того, чтобы крупные частицы почвы осели на дно, после чего с поверхности жидкости снимают всплывшие спорангии;

в) снятие спорангиев производят следующим образом. Центральную часть предметного стекла при помощи стеклянной палочки покрывают тонким слоем 4 - 5%-ного раствора желатина, нагретого до 40°С и дают желатину остыть. Пробирку для отсасывания покрывают предметным стеклом, обращенным желатиновым слоем вниз, а затем, осторожно открывая кран воронки, в пробирку медленно впускают жидкость до тех пор, пока ее поверхность не соприкоснется с предметным стеклом, после чего кран закрывают. Через 3 - 4 минуты предметное стекло снимают, покрывают покровным стеклом и просматривают прилипший к желатину слой под микроскопом. Просмотр ведут при окуляре 15х и объективе 8. Если спорангиев в препарате не окажется, их извлекают вторично. Для этого почву в пробирке снова взмучивают стеклянной палочкой и всплывшие на поверхность частицы снимают прежним способом;

г) при невозможности иметь описанный выше прибор анализ почвы методом А. Г. Николаева можно вести, пользуясь обычной химической пробиркой. В пробирку с равно отогнутыми краями насыпают 2 г исследуемой почвы, наливают нужную жидкость почти до верха и взбалтывают содержимое стеклянной палочкой. После этого пробирку ставят в штатив и накрывают предметным стеклом, обращенным желатиновым слоем вниз. Затем, как только верхняя часть жидкости просветлеет, снимают всплывающие частицы. С этой целью предметное стекло осторожно сдвигают до образования узкой щели между стенкой пробирки и предметным стеклам. Через образовавшуюся щель :в пробирку вносят жидкость каплями ив пипетки до тех пор, пока всплывшие частицы не коснутся желатинового слоя, после чего (Предметное стекло осторожно сдвигают в прежнее положение. Через 1 - 2 минуты предметное стекло снимают и прилипший к желатину слой просматривают под микроскопом;

д) недостатком прибора, рекомендуемого А. Г. Николаевым для анализа почвы, является то, что почву в пробирке взбалтывают стеклянной палочкой. Так как спорангии обладают высокой прилипаемостью, большая часть их может быть унесена стеклянной палочкой, что может сказаться особенно на результатах анализа слабо зараженной почвы. Поэтому рекомендуется в пробирке для отсасывания отводный тубус перенести вниз. Это позволит не прибегать к взбалтыванию почвы стеклянной палочкой, почва будет взмучиваться током жидкости, поступающей в пробирку снизу из делительной воронки.

19. Техника фитопатологического лабораторного анализа.

69. Для проведения фитопатологического лабораторного анализа необходимо иметь соответствующую оптику, аппаратуру, оборудование, мелкий инструментарий и лабораторную посуду.

20. Оптика.

70. Микроскоп является основным и важнейшим оптическим прибором для фитопатологических исследований. Он дает увеличение до 1300х и служит для изучения микроскопических объектов в проходящем свете. Существует много систем микроскопов, но в настоящее время в наших лабораториях пользуются преимущественно микроскопом отечественного производства, марки МБИ-1 (биологический микроскоп). Этот микроскоп очень удобен в работе благодаря тому, что имеет наклонный тубус и низко расположенные устройства макро - и микронаводки. Кроме того, к нему может быть приобретена бинокулярная насадка АУ-12, описание которой дается ниже. Правила пользования микроскопом следующие. При дневном освещении микроскоп устанавливают так, чтобы на зеркало не падали прямые лучи солнца. Микроскоп лучше располагать перед окном, обращенным на север. Работая при, искусственном освещении, можно пользоваться матовыми или молочного стекла электрическими лампами (75 - 100 ватт). Эффективнее при работе с микроскопом пользоваться специальными осветителями, которые дают равномерное и сильное освещение препарата. В настоящее время выпущены осветители типа ОИ-7. При искусственном освещении в особый держатель под столиком микроскопа вставляют светло - синий матовый светофильтр, а если свет очень резкий, то светофильтр из матового стекла. Плоское зеркало микроскопа употребляют в том случае, если источник света расположен далеко. При источнике света, расположенном близко, применяют вогнутое зеркало. Диафрагма служит для регулирования степени освещения поля зрения микроскопа, что позволяет получить более четкое изображение.

71. Осветив поле зрения, помещают на предметный столик микроскопа препарат и, глядя в окуляр, поднимают или опускают тубус при помощи макрометрического винта до тех пор, пока не станет видна верхняя поверхность стекла с препаратом. Установив таким образом тубус, осторожно передвигают препарат, чтобы отыскать нужный объект. Когда объект найден, то, вращая микрометрический винт, достигают возможно более ясного и четкого изображения. Начинают микроскопирование всегда при слабом увеличении, т. е. при окуляре 15х и объективе 8, а затем уже переводят на большее увеличение, пользуясь объективом 40.

72. Определение видов возбудителей грибных болезней связано с необходимостью микроскопических измерений спор, пикнид и т. д. Поэтому необходимо из вспомогательных приспособлений к микроскопу иметь окулярный и объективный микрометры.

73. Окулярный и объективный микрометры. С помощью окулярного микрометра производят непосредственное измерение микроскопических объектов. Объективный же микрометр (объектмикрометр) нужен только один раз: для определения абсолютной величины делений окулярного микрометра.

74. Окулярный микрометр представляет собой круглую стеклянную пластинку с нанесенной в центре линейкой длиной 1 см, разделенной на 100 частей по 0,01 см каждая.

Прежде чем пользоваться окулярным микрометром, нужно определить величину одного его деления три различных комбинациях, имеющихся при микроскопе окуляров и объективов. Для определения величины делений окулярного микрометра пользуются объективным микрометром. Последний имеет вид микроскопического препарата, у которого между предметным и покровным стеклами в центре нанесена линейка длиной в 1 мм, разделенная на 100 равных частей. Каждое деление объективного микрометра, таким образом, равно 10 микронам (0,01 мм). Чтобы определить величину одного деления окулярного микрометра при какой-либо комбинации окуляра и объектива, нужно знать, какое количество его делений умещается в определенном количестве делений объективного микрометра. С этой целью объективный микрометр помещают на предметный столик микроскопа, а окулярный микрометр вкладывают в окуляр, на диафрагму между верхней и нижней линзами, для чего предварительно отвинчивают верхнюю линзу окуляра. После этого устанавливают фокус и точно совмещают первые черты делений шкал обоих микрометров. Если при этом, например, в четырех делениях объективного микрометра точно умещается 20 делений окулярного микрометра, то, зная, что каждое деление объективного микрометра равно 10 микронам, а четыре его деления - 40 микронам, определяют, что 1 деление окулярного микрометра равно 2 микронам.

Расчет можно производить по формуле:

                             0,01 х X

                            ---------- = Z
                                 Y

где х - количество делений объективного микрометра, совпадающее с делениями окулярного микрометра; у - количество делений окулярного микрометра, совпадающее с делениями объективного микрометра; z - величина одного деления окулярного микрометра в микронах. Определение величины деления окулярного микрометра и все дальнейшие измерения во время работы всегда надо .производить при одной и той же длине тубуса микроскопа, выдвинутого до черты 160 мм. В микроскопе МБИ - 1 тубус установлен постоянно на эту длину. Полученные данные с указанием, для какой комбинации объектива и окуляра (а также при какой длине тубуса) они действительны, рекомендуется свести в табличку и хранить при микроскопе.

75. Стереоскопический микpоскоп МБС - 1. Этот микроскоп имеет минимальное увеличение 3,5х, а максимальное 119х, что не позволяет исследовать с его помощью микроскопические объекты. Несмотря на это, он имеет ряд преимуществ по сравнению с обычными микроскопами: он дает прямое, а не обратное и притом объемное изображение рассматриваемого предмета. Работы с этим микроскопом могут вестись как при искусственном, так и при естественном освещении в проходящем или отраженном свете. Смена объективов производится только поворотом рукоятки объективного барабана. При (всех увеличениях фокусное расстояние остается равным 64 миллиметрам, т. е. при смене объектива не приходится вновь наводить микроскоп на фокус. Такое большое фокусное расстояние и значительно большее поле зрения, чем в обычных микроскопах, позволяют использовать микроскоп МБС - 1 при экспертизе семян и других частей растений для обнаружения плодоношений грибов.

76. Бинокулярная насадка АУ - 12 - оптический прибор к микроскопу МБИ-1 предназначен для рассмотрения микроскопических объектов одновременно двумя глазами. Это значительно облегчает длительную работу при поисках спор в микропрепаратах и не утомляет зрения. Рассматриваемые через эту насадку объекты представляются объемными. Состоит она из двух тубусов, соединенных подвижно шаровидным корпусом; ставится она на микроскоп взамен монокулярного тубуса и закрепляется винтом.

21. Аппаратура.

77. Сушильный шкаф служит для стерилизации сухим жаром химической посуды. Он представляет собой камеру различной конструкции; в последнее время стали выпускать сушильные шкафы цилиндрической формы. Сверху шкаф имеет два отверстия - для термометра и вентиляции. Нагрев шкафа производится с помощью электронагревателей, находящихся или в нижней части шкафа, или между двойными стенками. Сушильный шкаф дает температуру до 220 градусов.

78. Термостат используют для проращивания семян, выявления их зараженности микроорганизмами, а также для культивирования выделенных возбудителей болезней растений. Он представляет собой камеру с двойными стенками, внутри которых помещены электронагреватели. Термостат имеет два отверстия - одно для терморегулятора, другое для термометра. С помощью терморегулятора в термостате в течение длительного срока можно поддерживать определенную температуру.

79. Аппарат Коха (кипятильник) применяется для стерилизации питательных сред текучим паром. Состоит кипятильник из металлического бака, закрывающегося сверху крышкой с двумя отверстиями: одно для термометра, другое для выхода пара. В аппарат Коха наливается вода, над поверхностью которой на специальной металлической подставке с отверстиями для прохождения пара помещают стерилизуемые предметы. Время стерилизации отсчитывают с момента непрерывного выхода пара.

80. Автоклав служит для стерилизации питательных сред насыщенным паром под давлением. Представляет он собой медный толстостенный, герметически закрывающийся котел, в котором можно получить давление водяного пара до 2 - 3 атмосфер. Удобнее всего пользоваться автоклавом с электрическим обогревом. Автоклав снабжен кранами для выхода воздуха и пара, манометром для определения давления пара внутри котла и предохранительным клапаном. В автоклав до определенного уровня наливают воду. На металлическую подставку ставят стерилизуемые среды, герметически завинчивают крышку и, включив нагрев, доводят давление пара до нужного показателя. Техника работы с сушильным шкафом, аппаратом Коха и автоклавом подробно указана в разделе "Стерилизация питательных сред и посуды".

81. Центрифуга применяется для осаждения частиц, находящихся в жидкости во взвешенном состоянии. Центрифуги бывают нескольких типов: открытые, закрытые, ручные и электрические. Открытая ручная центрифуга состоит из вертикальной вращающейся оси, перпендикулярно которой на верхнем конце ее прикреплена планка с подвижно укрепленными на ней двумя (или четырьмя) металлическими гильзами. В эти гильзы вставляются специальные, суженные к низу пробирки с жидкостью, в которой необходимо осадить взвешенные частицы. При быстром вращении центрифуги все находящиеся в воде или в какой - либо жидкости частицы, в том числе споры грибов, благодаря центробежной силе опускаются .на дно пробирки, образуя осадок. Пробирки наполняют так, чтобы расстояние от края до уровня жидкости было не менее 10 мм. Пускают центрифугу не сразу на полный ход, а постепенно. Это относится как к ручным, так и к электрическим центрифугам.

82. Водяная баня при фитопатологических работах применяется в основном для разогревания питательных сред. Она представляет собой цилиндрический, чаще круглодонный металлический (обычно из красной меди) сосуд, закрывающийся крышкой, состоящей из набора колец разного диаметра, концентрически налегающих одно на другое. В сосуд наливают воду настолько, чтобы до краев оставалось 2 - 3 см. Нагреваемую колбу с питательной средой помещают на кольцо такого диаметра, чтобы ее дно заходило на 1,5 - 2 см внутрь бани. Особенностью этой бани является то, что разогреваемая питательная среда не доводится до кипения, так как ее температура не поднимается выше 97 - 98 градусов.

83. Кроме перечисленного основного оборудования, необходимо иметь технические весы с набором разновесов, лобные бинокулярные и ручные лупы.

84. Из мелких инструментов для фитопатологических работ необходимы: бритвы, скальпели, пинцеты, препаровальные иглы и иглы для пересевов (платиновые), ножницы. Вспомогательным оборудованием являются: почвенные сита, фарфоровые ступки, спиртовки, штативы для пробирок (металлические и деревянные), металлические корзинки для стерилизуемых в автоклаве или аппарате Коха пробирок.

85. При лабораторных фитопатологических анализах наиболее часто употребляется следующая химическая посуда, без которой нельзя провести большинство работ: химические и центрифужные пробирки, колбы конические Эрленмейера, чашки Петри и Коха.

86. Химические пробирки применяются главным образом для культивирования грибов на искусственных твердых и жидких питательных средах.

87. При анализе семян на механическую засоренность спорами головневых и других грибов, который проводится методом обмывки семян и последующего исследования центрифугата, применяют центрифужные пробирки.

88. Обычно при лабораторных фитопатологических исследованиях пользуются чашками Петри диаметром 8 - 10 см. Растительный материал, подозрительный на зараженность грибами, закладывают в них на увлажненную фильтровальную бумагу (влажная камера) или на питательную среду. Эти чашки удобны тем, что колонии грибов на питательной среде можно в них рассматривать под микроскопом при малом увеличении, перевернув чашку нижней стороной вверх.

89. Колбы Эрленмейера, в которых обычно производят варку искусственных питательных сред для культивирования грибов, употребляют различной емкостью от 100 до 1000 мл.

90. Кроме того, необходимы для работы предметные и покровные стекла, часовые стекла, стеклянные воронки, химические стаканы различной емкости, кристаллизаторы, мерные цилиндры, пипетки, эксикаторы, капельницы, фарфоровые тигельки и чашки для выпаривания.

22. Подготовка лабораторной посуды.

91. Лабораторная посуда, употребляемая при фитопатологических анализах, должна быть совершенно чистой, обезжиренной. Чтобы проверить, достаточно ли чисто вымыта посуда, ее нужно ополоснуть водой, затем воду слить и посуду перевернуть вверх дном. Вода должна стекать, оставляя на стенках тонкую ровную водяную пленку. Если при этом на стекле останутся отдельные капли воды, то это свидетельствует о том, что стекло вымыто недостаточно и такую посуду надо мыть снова. Новую стеклянную посуду, прежде чем пустить в употребление, кипятят в 1 %-ном растворе соляной кислоты, после чего тщательно промывают водой. Посуду со следами агара, желатина и других питательных сред за сутки перед мытьем намачивают в щелоке, приготовленном из печной золы или технического едкого натрия, так называемой каустической соды.

92. Затем посуду обрабатывают химическим путем, для чего чаще всего применяется хромовая смесь или марганцовокислый калий. Для приготовления хромовой смеси на литр воды берут 50 г двухромовокислого калия и 100 г технической серной кислоты:

а) при мытье посуды хромовой смесью рекомендуется сначала промыть ее водой, по возможности удалить механическим путем твердые загрязнения (налеты, осадки, остатки питательных сред), если они имеются, и только после этого наливать в посуду хромовую смесь приблизительно на 1/4 объема посуды. Затем хромовой смесью осторожно обмывают стенки посуды, наклоняя и поворачивая ее во все стороны. После этого медленно выливают хромовую смесь в ту банку, в которой она хранится. Приготовленная один раз хромовая смесь может применяться многократно. Она делается непригодной только тогда, когда цвет ее из оранжево - красного станет зеленым. Обращаться с хромовой смесью надо очень осторожно, так как она ядовита и, кроме того, из - за наличия в ее составе серной кислоты дает ожоги кожи, портит одежду и обувь. Если это заметить вовремя, то действие ее можно прекратить, обмыв место, куда она попала, сначала слабым раствором щелочи (соды или др.), а затем хорошо промыв водой:

б) марганцовокислый калий для мытья посуды применяют в виде 4 - 5%-ного раствора. Наливают в посуду раствор этой соли и добавляют в него немного концентрированной серной кислоты; при этом раствор становится теплым. Посуду этим раствором моют также, как и хромовой смесью. После обработки раствором марганцовокислого калия на стенках посуды может остаться бурый налет. Его удаляют обработкой соляной или щавелевой кислотой. Раствор марганцовокислого калия для мытья посуды используется только один раз, после чего его выливают:

в) посуду, вымытую хромовой смесью и марганцовокислым калием, ополаскивают не менее 5 - 6 раз водопроводной водой, а потом дистиллированной. После мытья посуду сушат при комнатной температуре или в сушильном шкафу при температуре 50°С.

23. Стерилизация питательных сред и посуды.

93. Стерилизацией называется полное обеззараживание от микроорганизмов какой-либо среды. Чаще всего применяется стерилизация нагреванием. Существует несколько способов стерилизации: текучим паром, паром под давлением и сухим жаром. Питательные среды, приготовляемые для культивирования грибов и других микроорганизмов, стерилизуются текучим паром или паром под давлением.

94. Стерилизация текучим паром производится в аппарате Коха. Текучий пар образуется при кипении воды, налитой на дно кипятильника до уровня металлической сетки, на которую ставят для стерилизации колбы и пробирки с питательными средами, помещенные в проволочные корзинки. Время начала стерилизации отмечают с момента выхода пара непрерывной струей из отверстия в крышке и с момента показаний термометра 100°С. Стерилизация сред производится обычно три дня подряд в течение часа.

95. Стерилизация под давлением является более надежным способом стерилизации и производится в автоклаве. Применяется она в тех случаях, когда требуется температура выше 100°С, и проводится следующим образом. В автоклав вливается вода до определенного уровня. На металлическую сетку ставят химическую посуду со стерилизуемой средой. После этого герметически привинчивают крышку автоклава и, оставив открытым воздушный кран, включают нагрев. Край оставляют открытым до тех пор, пока не выйдет из котла весь воздух и не начнет выходить непрерывной струей пар. Закрыв кран, доводят давление по манометру до одной или полутора атмосфер и поддерживают его в течение часа, после чего прекращают нагрев автоклава. Когда стрелка манометра упадет до нуля, открывают кран и только после этого отвинчивают крышку автоклава. Если кран будет открыт слишком рано, то от быстрого понижения давления стерилизуемая жидкость может вскипеть и выбросить ватные пробки, которыми закрыты колбы и пробирки.

96. В автоклаве можно стерилизовать питательные среды и без давления. В таком случае воздушный кран автоклава совсем не закрывают и пар свободно выходит из автоклава во время стерилизации.

97. Чашки Петри, чашки Коха, химические пробирки и другую лабораторную стеклянную посуду стерилизуют сухим жаром в сушильном шкафу. Перед стерилизацией пробирки закрывают ватными пробками, а чашки завертывают в бумагу. Сушильный шкаф загружают так, чтобы между посудой и стенками шкафа оставались промежутки. Это делается для того, чтобы в сушильном шкафу температура воздуха везде была ровная. Стерилизацию проводят при температуре 130°С в течение двух часов или при температуре 170°С в течение полутора часов. Поднимать, температуру выше 170°С не следует, т. к. будут обугливаться ватные пробки и бумага. Вынимают простерилизованную посуду только после того, как шкаф остынет.

98. Мелкие инструменты: пинцеты, скальпели, ножницы и др. стерилизуют путем проведения их несколько раз через пламя спиртовки, предварительно погружая в спирт (ректификат или денатурат). Иглы для пересева стерилизуют также обжиганием в пламени, но без предварительного погружения в спирт. Прогревают вначале стеклянную палочку, проводят ею горизонтально в пламени горелки до тех пор, пока она хорошо не прогреется. После этого держат иглу вертикально над пламенем горелки, прогревают проволочку до красного каления три раза.

99. Простерилизованные инструменты помещают на стерильную подставку для остывания, при этом концы их не должны касаться стола или каких - либо предметов, чтобы не загрязниться вновь. Мелкие металлические инструменты рекомендуется периодически стерилизовать кипячением в воде, добавляя в нее соду.

24. Приготовление питательных сред для грибов.

100. Для культивирования грибов и выделения их из растительного материала применяют различные питательные среды. Питательные среды бывают естественные (природные) и искусственные. К первым относятся: зерно, плоды, овощи, стебли и пр. Искусственные среды - вытяжки или отвары из плодов, овощей - готовятся путем переработки естественных продуктов. При этом для того, чтобы сделать жидкую среду твердой, добавляют к ней агар или желатин.

101. Агар является продуктом переработки морских водорослей. Он содержит мало питательных веществ, но придает среде плотную консистенцию, на которой грибы хорошо растут и дают плодоношения. Агар бывает в продаже в виде порошка, но чаще в виде тонких узких прессованных полосок. Агара для приготовления питательных сред берут в количестве от 2 до 40%.

102. Агаровые среды приготовляются следующим образом: агар нарезают мелкими кусочками, замачивают в течение 4 часов в химической колбе, наполненной половинным количеством воды, требуемой для приготовления среды, после чего нагревают в аппарате Коха или на водяной бане для расплавления агара. Затем, когда агар расплавится, к нему добавляют растворенные в воде составные части приготовляемой питательной среды согласно рецепту. Добавляют воду до нужного объема и стерилизуют. В зависимости от состава среды стерилизация производится или в автоклаве под давлением в одну атмосферу в течение часа или текучим паром в аппарате Коха два дня по одному часу.

103. При застывании агара выделяется вода на поверхности среды и на стенках посуды. Чем медленнее застывает агар, тем меньше выделяется капель воды. Поэтому рекомендуется не вынимать колбы или пробирки из автоклава или аппарата Коха со стерилизованной средой до тех пор, пока они не остынут. Кроме того, чтобы избежать выделения воды, к агаровой среде добавляют 2% желатина. Агаровые среды в большинстве случаев не просветляют, но если это необходимо, то поступают следующим образом: берут белок от одного куриного яйца (из расчета на один литр воды), взбивают его до появления легкой пены и вливают в теплую, но не горячую среду. Затем начинают нагревать эту смесь, доводя ее до кипения. Смесь кипятят 10 минут, после чего фильтруют через марлю для удаления сгустков белка. Затем в воронке для горячего фильтрования или в нагретом аппарате Коха фильтруют ее через обыкновенный бумажный фильтр.

104. Желатин является продуктом животного происхождения. Он так же, как и агар, не содержит веществ, питательных для грибов, и применяется для того, чтобы придать твердость питательным средам. Для приготовления питательных сред берут 10 - 12% желатина. Недостатком желатиновых сред является то, что они разжижаются уже при 24 - 26°С, кроме того, при сильнокислой реакции они не застывают. Поэтому наиболее часто употребляются агаровые среды. Приготовленные питательные среды сохраняют в колбах или пробирках. Разливку сред по пробиркам производят сразу же, чтобы не дать среде застыть. Колбы и пробирки, в которые разливают питательную среду, закрывают ватными пробками.

105. Ватные пробки изготовляют из гигроскопической ваты следующим образом: кусок ваты расправляют на столе в виде продолговатой четырехугольной пластинки, загибают ее края внутрь, чтобы получить ленточку шириной, соответствующей длине пробки, и скатывают из нее валик размером, равным диаметру пробирки. Пробка должна быть туго свернутой и плотно входить в пробирку, но вместе с тем и достаточно легко выниматься из пробирки. В пробирку пробка должна входить на 2 см, а ее конец, выходящий наружу, должен составлять не менее 1/3 длины всей пробки.

106. Чтобы при разливке среды не смачивать края стенок пробирки, поступают следующим образом. Стеклянную воронку вставляют в металлический или деревянный штатив. На конец воронки надевают тонкую резиновую трубочку с зажимом и стеклянной трубочкой на конце. В воронку наливают питательную среду, а конец стеклянной трубочки опускают в пробирку и, ослабляя зажим, наливают нужное количество среды. Обычно в каждую пробирку наливают по 4 мл среды, если готовят ее с наклонно застывшей поверхностью (косяки), и по 8 мл, если она нужна для разливки в чашки Петри. Затем пробирки помещают в проволочную корзину для того, чтобы во время стерилизации они были в вертикальном положении, хорошо закрывают их сверху бумагой, чтобы не намокли пробки, и ставят для стерилизации в аппарат Коха или в автоклав.

107. После стерилизации пробирки или оставляют в проволочной корзине для застывания, или придают им наклонное (косое) положение. Косая поверхность удобна тем, что площадь питательной среды при этом увеличивается и это значительно облегчает наблюдение за развитием гриба. В таком положении пробирки остаются до тех пор, пока питательная среда не станет твердой. Агаровые среды, предназначенные для чашек Петри, не следует разливать очень горячими, чтобы избежать большой отдачи воды. Производить разливку сред в пробирки следует с расчетом, чтобы они хранились или были использованы в течение месяца.

108. Питательные среды рекомендуется хранить при комнатной температуре. Если приготовленная питательная среда не полностью разлита по пробиркам, то остаток ее стерилизуют повторно ввиду возможного загрязнения микроорганизмами во время разливки.

25. Рецепты питательных сред для культивирования грибов.

109. Искусственные среды:

а) Картофельный агар. 100 г вымытого, очищенного, нарезанного мелкими ломтиками картофеля заливают 500 мл воды и кипятят в течение 40 минут. Затем жидкость отфильтровывают, добавляют воду, восстанавливая объем до 500 мл, и 10 г сухого агара, затем стерилизуют в текучем пару до полного расплавления агара. После стерилизации прибавляют в среду лимонную кислоту на кончике скальпеля, после чего агар разливают по пробиркам и стерилизуют в аппарате Коха два дня подряд по одному часу;

б) Двухпроцентный картофельно-глюкозный агар. Берут 100 г очищенного, вымытого картофеля, 10 г глюкозы и 10 г агара на 500 мл воды. Картофель нарезают ломтиками, заливают водой и кипятят в течение 40 минут, затем жидкость фильтруют, восстанавливают добавлением воды объем до прежнего и прибавляют агар. Смесь стерилизуют в аппарате Коха до полного расплавления агара. После этого добавляют глюкозу, смесь хорошо размешивают, разливают в пробирки и стерилизуют текучим паром два дня по одному часу;

в) Овсяный агар. 25 г овсяного толокна или 50 г слегка растолченных овсяных зерен заливают 500 мл воды, оставляют на сутки при комнатной температуре. Затем жидкость отфильтровывают через вату или через несколько слоев марли, прибавляют к ней 20 г агара и ставят в аппарат Коха до полного расплавления агара. Полученный таким образом овсяный агар разливают по пробиркам и стерилизуют текучим паром в течение двух дней по одному часу;

г) Пивное сусло с агаром. В пивном сусле определяют сахарометром содержание сахара и добавляют воды столько, чтобы процент его был от 5 до 10 (желательно 7). Чаще всего это выражается следующим соотношением: 1 часть пивного сусла на 3 - 5 частей воды. В разбавленное водой сусло добавляют 2% агара. После полного расплавления агара в аппарате Коха приготовленную среду разливают по пробиркам и стерилизуют текучим паром два дня подряд по одному часу;

д) Мальце - пептонный агар. 10 г мелко нарезанного агара несколько часов замачивают в 250 мл воды, добавляют еще 250 мл воды и ставят в аппарат Коха до полного расплавления агара. После этого небольшую часть жидкости немного охлаждают, размешивают в ней 5 г пептона и выливают обратно в колбу. Добавляют 10 г мальц - экстракта и затем всю жидкость нагревают 10 минут в аппарате Коха. После этого добавляют в питательную среду на кончике скальпеля лимонную кислоту, разливают по пробиркам и стерилизуют текучим паром два дня по одному часу;

е) Картофельный желатин. 100 г вымытого, очищенного картофеля разрезают на маленькие кусочки, опускают в 150 мл воды, варят в течение полутора часов, затем фильтруют. После этого восстанавливают объем, добавляют 10 г желатина, стерилизуют текучим паром по одному часу два дня подряд.

110. Синтетическая среда Чапека. В 100 мл горячей воды растворяют следующие соли (в граммах):

а) азотнокислый натрий 0,2

б) фосфорнокислый калий однозамещенный 0,1

в) сернокислый магний 0,05

г) хлористый калий 0,05

д) сернокислое железо 0,001 К этому составу добавляют 3г сахара.

Соли и сахар растворяют в горячей воде, затем фильтруют через бумажный фильтр и стерилизуют в автоклаве 'При давлении в одну атмосферу в течение 15 минут. Сюда же может быть добавлен агар в количестве 2% (агар по Чапеку).

111. Естественные среды:

а) Kартофель свежий. Клубни картофеля моют в проточной воде щеткой, выдерживают 30 минут в растворе сулемы 1:1000, тщательно промывают в водопроводной, затем в стерильной воде, обсушивают на воздухе и далее очищают стерильным ножом кожуру. У очищенного клубня срезают оба конца, затем нарезают ломтики толщиной 3 - 3,5 см. Из ломтиков нарезают стерильным ножом или стерильным сверлом брусочки или цилиндрики. Эти брусочки или цилиндрики помещают в заранее приготовленные стерильные пробирки с небольшим количеством воды в них (1-1,5 мл). Приготовленная таким образом среда готова для использования;

б) Стерилизованный картофель. Картофель хорошо моют и очищают, нарезают в виде цилиндриков, опускают в пробирки и стерилизуют без добавления воды текучим паром по одному часу два дня подряд. Можно стерилизовать под давлением в одну атмосферу 30 минут;

в) Рис. На один объем риса (крупа), положенного в колбу или пробирку, берут два объема воды. Все это стерилизуют текучим паром два дня подряд по одному часу;

г) Корни и стебли различных растений. Очищенные от почвы корни и стебли растений разрезают на кусочки длиной 5 - 7 см и вымачивают в течение двух часов в воде. В каждую пробирку опускают по одному кусочку стебля или корня, добавляют воду от 1 до 1,5 мл и стерилизуют текучим паром по одному часу в течение двух дней. Лучшей средой для культивирования многих грибов являются стебли донника.

26. Выделение грибов из различного растительного материала.

112. Выделение грибов из семян:

Анализ семян на выявление возбудителей грибных болезней начинают с наружного осмотра семян, который производится при помощи лупы.

Наружным осмотром могут быть выявлены головневые зерна, спорынья, склероции и различные плодоношения грибов на самих семенах. При этом осмотре также могут быть выявлены семена с признаками внутренней грибной инфекции, т. е. щуплые, со сморщенной семенной оболочкой, потерявшие нормальный цвет, а также имеющие различного рода пятна. Если на семенах нет зрелых плодоношений гриба, позволяющих определить возбудителя болезни, прибегают к анализу биологическим методом.

113. Биологический метод анализа основан на том, что для грибов, наличие которых предполагается внутри семян, создаются оптимальные условия развития и роста. Этот метод имеет несколько форм, из которых наиболее часто применяется закладка семян во влажные камеры, т. е. помещение их в оптимальные условия влажности и температуры или раскладка семян на твердые питательные среды. В качестве влажной камеры для семян используются чашки Петри, в которые вкладывают вырезанную кружками фильтровальную бумагу или марлю. Бумагу кладут в 2 слоя, а марлю в 3 слоя. Между слоями бумаги, положенной на дно чашки, иногда прокладывают тонкий слой ваты. После этого чашки закрывают, завертывают каждую отдельно в бумагу и стерилизуют в сушильном шкафу. Перед тем как положить семена в чашки, фильтровальную бумагу или марлю увлажняют стерильной свежепрокипяченной водой, для чего крышку чашки слегка приоткрывают. Воды для увлажнения берут такое количество, чтобы была смочена вся бумага, но не было избытка ее на поверхности бумаги. Раскладку семян в чашки проводят в стерильных условиях, для чего дезинфицируют рабочее место, пинцет, которым берут семена, и другие употребляемые инструменты.

114. Если целью анализа является обнаружение грибов, имеющихся на поверхности семян, последние перед закладкой их во влажную камеру не дезинфицируют. Если же необходимо выявить внутреннюю инфекцию, то прибегают к наружной дезинфекции семян. Семена дезинфицируют 1%-ным раствором марганцовокислого калия с последующей промывкой в стерильной воде или на 1 - 2 минуты опускают в 96%-ный спирт, после чего обсушивают между двумя листами стерильной фильтровальной бумаги. Чашки Петри с разложенными в них семенами ставят в термостат, где поддерживается температура 22 - 25°С. Наблюдения за ростом гриба начинают через 3 - 4 дня после посева семян, как только появится мицелий грибка. Фильтровальную бумагу в чашках по мере ее высыхания увлажняют стерильной водой.

115. Посев семян на твердые питательные среды применяется главным образом для выявления скрытой зараженности семян грибами. Питательная среда в пробирках подогревается в водяной бане или в стакане с горячей водой. После того как среда сделается жидкой, ее разливают в стерилизованные чашки Петри. При выливании среды из пробирки крышку чашки только слегка приподнимают с одной стороны, чтобы в нее не попали споры из воздуха. Осторожным вращением чашки распределяют среду равномерно по всей поверхности ее дна. После этого чашки ставят на горизонтальную поверхность для застывания среды. Агаровые среды застывают быстро, желатиновые - медленнее. Когда питательная среда в чашках застынет, на нее раскладывают семена. Так же, как и при закладке семян во влажные камеры, семена или не дезинфицируют, если посев производят с целью выявления поверхностной грибной инфекции, или дезинфицируют, если анализ ведется на выявление скрытой зараженности. Посев семян проводят в стерильных условиях и стерильным пинцетом. Чашку во время высева семян приоткрывают только слегка. После того как семена разложены на питательной среде, на чашках надписывают цветным восковым карандашом или специальными чернилами дату посева и номер образца (рецепт чернил для стекла: смесь 10 см^3 обычных чернил с 3 см^3 кремнекислого натрия - жидкого стекла). После этого чашки завертывают в бумагу, в которой они стерилизовались, и ставят в термостат, где поддерживается температура 22 - 25°С.

116. Через 2 - 3 дня начинают наблюдать за ростом гриба. Повернув чашку Петри нижней стороной к объективу микроскопа, просматривают рост и характер колоний при малом увеличении (окуляр 15х, объектив 8). Иногда для более быстрого обнаружения скрытой зараженности предварительно продезинфицированные семена разрезают пополам стерильным скальпелем и разрезанной поверхностью кладут на питательную среду. Через несколько дней, когда начнет появляться грибница, ее переносят стерильной платиновой иглой в пробирки с питательной средой для получения чистой культуры гриба, к определению которого приступают после образования плодоношений.

117. Пересев гриба из чашки в пробирки производят следующим образом: пробирку с питательной средой берут между большим и указательным пальцами левой руки так, чтобы пробирка находилась почти в горизонтальном положении. Вынув затем ватную пробку и прижав ее мизинцем к ладони правой руки таким образом, чтобы часть пробки, бывшая внутри пробирки, не касалась руки, слегка обжигают край пробирки над пламенем спиртовки и прокаленной, но несколько остывшей иглой наносят на поверхность питательной среды кусочек мицелия, взятый из чашки. После этого опять обжигают горлышко пробирки и закрывают ее ватной пробкой, предварительно проведя внутреннюю часть пробки также через пламя спиртовки.

118. Если в чашках Петри появляется мицелий гриба, загрязненный сапрофитными микроорганизмами, то его очищают методом разливки и только после этого пересевают в пробирки. Метод разливки заключается в следующем: стерильной иглой берут из чашек кусочки мицелия, по возможности со спорами, если они образовались, и переносят в разогретую жидкую питательную среду. Закрыв пробирку пробкой, начинают вращать ее между ладонями, чтобы кусочки мицелия и споры разошлись в питательной среде. Затем из пробирки выливают питательную среду в стерильную чашку Петри. Когда отдельные колонии гриба появятся в чашках Петри, их пересевают в пробирки с питательной средой.

119. Для первоначальных пересевов грибов лучшей средой является стандартная желатиновая среда или сусловый агар. Если колонии гриба очень маленькие, их стерильной иглой снимают и целиком переносят в пробирки с питательной средой. Если же колонии уже развиты, то снимают и переносят на питательную среду в пробирку часть колонии. Иногда, несмотря на принятые предосторожности, в пробирках наблюдается рост двух или нескольких видов грибов. В таком случае для их разделения вторично прибегают к методу разливки или используют следующие методы выделения: питательную среду разливают в чашки Петри, дают ей застыть. Кусочки мицелия, взятые из чашки или пробирки, разбалтывают в пробирке со стерильной водой. На поверхность питательной среды наносят несколько капель стерильной воды, содержащей кусочки мицелия или споры. Через несколько дней начинают вести наблюдения за ростом гриба под микроскопом, просматривая чашки с нижней стороны при малом увеличении. При появлении чистых колоний их переносят на питательную среду в пробирки.

120. Для получения чистых отдельных колоний гриба иногда прибегают к другому методу: на твердую питательную среду (желательно желатиновую), разлитую в чашки Петри, наливают на 1 - 2 минуты стерильную воду, содержащую небольшое количество спор, после чего эту воду быстро сливают. Через 2 - 3 дня, просматривая чашки Петри с нижней стороны при малом увеличении, находят отдельно лежащие споры, обводят эти места тушью и по мере образования колоний пересевают их в пробирки с питательной средой.

27. Выделение грибов из плодов.

121. Выделение грибов с поверхности плодов производят методом проращивания грибницы во влажной камере. Для этого исследуемый материал помещают в стерильную чашку Коха, на дно которой положена фильтровальная бумага, смоченная стерильной водой. Если гриб во влажной камере через несколько дней не даст плодоношений, то производят пересев мицелия на питательную среду.

122. При выделении грибов из внутренних частей плодов поступают следующим образом: плоды дезинфицируют 2 - 3 минуты в 96°-ном спирте, обсушивают стерильной фильтровальной бумагой, снимают стерильным скальпелем кожицу и разрезают плод на мелкие кусочки, которые раскладывают на питательную среду в чашки Петри на значительном расстоянии друг от друга. Иногда плоды, предварительно продезинфицированные, разрезают стерильным скальпелем на две части и помещают в чашки Коха разрезанной поверхностью вверх, на которой и появляется мицелий гриба.

28. Выделение грибов из стеблей и подземных частей растений.

123. При выделении грибов с поверхности стеблей или подземных частей растений (корней, корневищ и пр.) пользуются методом влажной камеры с последующим пересевом появившегося мицелия в пробирки с питательной средой. При загрязненной культуре прибегают к методу разливки.

124. При выделении грибов из внутренних частей стебли и особенно корни и корневища тщательно моют, последние помещают для этого не менее чем на 1/2 часа под сильную струю воды, чтобы отмыть почву, просушивают фильтровальной бумагой, опускают на 2 - 3 секунды в 96°-ный спирт, после чего прожигают в пламени спиртовки. Затем делают поперечные или продольные срезы бритвой и в стерильных условиях раскладывают их на твердую питательную среду.

29. Выделение грибов из листьев.

125. Выделение грибов с поверхности листьев производится так же, как и с поверхности плодов. При выделении грибов из внутренней части листьев поступают следующим образом: небольшую часть листа с признаками заболевания опускают в спирт на 2 - 3 секунды, промывают после этого несколько раз в стерильной воде и, положив на стерильное предметное стекло, расщепляют на мелкие кусочки, которые и закладывают на твердую питательную среду в чашки Петри. После появления роста гриба в чашках производят пересев в пробирки на питательную среду.

30. Микроскопические препараты.

126. Микроскопические препараты приготовляют следующим образом:

а) Временные препараты. Пипеткой или концом стеклянной палочки наносят на чистое предметное стекло каплю дистиллированной или свежепрокипяченной воды. Скальпелем или препаровальной иглой соскабливают с поверхности исследуемого растительного материала часть пораженной ткани с мицелием или плодоношением гриба или же делают бритвой тонкий срез этой ткани. Соскоб или срез переносят в каплю воды на предметном стекле. После этого каплю осторожно покрывают покровным стеклом и препарат рассматривают под микроскопом. Каплю воды берут таких размеров, чтобы вода не выходила за края покровного стекла;

б) Постоянные препараты. Для получения постоянного препарата приготовленный микроскопический препарат заделывают в глицерин - желатин, который приготовляют следующим образом: 5 г желатина помещают в колбу, заливают 30 мл воды и оставляют набухать в течение нескольких часов. Затем, подогревая колбу с желатином, вливают 35 мл глицерина и добавляют фенол на кончике скальпеля. Для просветления смеси берут белок куриного яйца. Сначала белок разбавляют в небольшом количестве остуженной смеси, затем вливают в остальную теплую, но не горячую смесь и тщательно размешивают, чтобы получить однородную жидкость. Нагревают жидкость до кипения. Белок свертывается, увлекая всю муть, в результате жидкость получается прозрачной. Осадок отфильтровывают через вату с помощью воронки для горячего фильтрования и прозрачный глицерин - желатин разливают по пробиркам, которые закрывают резиновыми или корковыми пробками.

Заделка постоянного микроскопического препарата в глицерин - желатин производится следующим образом: соскоб или тонкий срез с исследуемого материала помещают в каплю расплавленного глицерин - желатина, нанесенного на нагретое предметное стекло. Каплю глицерин - желатина осторожно покрывают покровным стеклом.

127. Если нужно приготовить постоянный микроскопический препарат из временного препарата, то поступают следующим образом. После того как вода в препарате высохнет, кусочек твердого глицерин - желатина наносят к одному краю покровного стекла. Осторожно проводя предметное стекло над пламенем горелки, расплавляют глицерин - желатин, он всасывается под покровное стекло и застывает, когда прекратится прогревание стекла. Для лучшей сохранности постоянных препаратов их окантовывают по краям покровного стекла, лаком. Для этой цели имеются специальные лаки, но можно применять обычный асфальтовый или мебельный лак.

128. Для постоянной надписи на микропрепарате можно пользоваться тушью для стекла. Место с надписью нагревают над пламенем спиртовки до появления белого пара, чтобы тушь хорошо пристала к стеклу. Нагревать препарат надо очень осторожно, чтобы не расплавился глицерин - желатин, поэтому над пламенем надо держать только ту часть предметного стекла, где сделана надпись.

129. Контроль за выполнением настоящей Инструкции возлагается на Государственную службу ветеринарного и фитосанитарного благополучия и иные органы государственной власти в пределах компетенции, установленной действующим законодательством Приднестровской Молдавской Республики.

130. Ответственность за нарушение настоящей Инструкции устанавливается действующими нормативными правовыми актами Приднестровской Молдавской Республики.