BAA

ОБ УТВЕРЖДЕНИИ "МЕТОДИЧЕСКИХ УКАЗАНИЙ
ПО ДИАГНОСТИКЕ ЛЕПТОСПИРОЗА ЖИВОТНЫХ НА ТЕРРИТОРИИ
ПРИДНЕСТРОВСКОЙ МОЛДАВСКОЙ РЕСПУБЛИКИ"

ПРИКАЗ

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОЙ ЗАЩИТЫ
ПРИДНЕСТРОВСКОЙ МОЛДАВСКОЙ РЕСПУБЛИКИ

8 февраля 2012 г.
N 82

(САЗ 12-10)

В соответствии с Законом Приднестровской Молдавской Республики от 20 декабря 1994 года "О ветеринарной деятельности" (СЗМР 94-4) с изменениями и дополнениями, внесёнными законами Приднестровской Молдавской Республики от 10 июля 2002 года N 152-ЗИД-III (САЗ 02-28), от 3 апреля 2006 года N 18-ЗИД-IV (САЗ 06-15), от 6 июля 2007 года N 253-ЗИ-IV (САЗ 07-28), от 23 сентября 2009 года N 864-ЗИД-IV (САЗ 09-39) с Постановлением Правительства Приднестровской Молдавской Республики от 12 мая 1995 года N 156 "Об утверждении Ветеринарного Устава Приднестровской Молдавской Республики" (САМР 95-5) с Указом Президента Приднестровской Молдавской Республики от 3 апреля 2007 года N 256 "Об утверждении Положения, структуры и штатной численности Министерства здравоохранения и социальной защиты Приднестровской Молдавской Республики" (САЗ 07-15) с изменениями и дополнениями, внесёнными указами Президента Приднестровской Молдавской от 18 сентября 2007 года N 612 (САЗ 07-39), от 12 января 2008 года N 25 (САЗ 08-1), от 21 мая 2008 года N 308 (САЗ 08-20), от 19 августа 2008 года N 524 (САЗ 08-33), от 30 сентября 2008 года N 636 (САЗ 08-39), от 4 февраля 2009 года N 70 (САЗ 09-6), от 15 июня 2009 года N 410 (САЗ 09-25), от 27 января 2010 года N 40 (САЗ 10-4), от 7 сентября 2010 года N 716 (САЗ 10-36), Указом Президента Приднестровской Молдавской Республики от 18 мая 2011 года N 330 "Об утверждении Положения о Государственной службе ветеринарного и фитосанитарного благополучия Министерства здравоохранения и социальной защиты Приднестровской Молдавской Республики" (САЗ 11-20), в целях предотвращения распространения болезней общих для человека и животных, приказываю:

1. Утвердить "Методические указания по диагностике лептоспироза животных на территории Приднестровской Молдавской Республики" (Приложение).

2. Направить настоящий Приказ на государственную регистрацию в Министерство юстиции Приднестровской Молдавской Республики.

3. Контроль за исполнением настоящего Приказа возложить на начальника Государственной службы ветеринарного и фитосанитарного благополучия, Главного государственного ветеринарного инспектора Приднестровской Молдавской Республики Перстнёва А.Ф.

4. Настоящий Приказ вступает в силу со дня официального опубликования.

 г. Тирасполь
8 февраля 2012 г.
       N 82

Приложение к Приказу
Министерства здравоохранения
и социальной защиты
Приднестровской Молдавской Республики
от 8 февраля 2012 года N 82

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ПО ДИАГНОСТИКЕ ЛЕПТОСПИРОЗА ЖИВОТНЫХ
НА ТЕРРИТОРИИ ПРИДНЕСТРОВСКОЙ МОЛДАВСКОЙ РЕСПУБЛИКИ

1. Общие положения

1. Лептоспироз представляет собой зооантропонозную природноочаговую инфекцию домашних, промысловых, многих видов диких животных и человека. Лептоспирозом болеют крупный рогатый скот, свиньи, лошади, овцы, козы, олени, собаки, лисицы, песцы и животные других видов.

2. Возбудителем болезни являются лептоспиры. Они относятся к семейству спирохет (Spirochetaceae), роду лептоcпир (Leptospira), виду патогенных лептоспир (interrogans). Последний включает 124 серологических варианта (серотипа - серовара). Серологические варианты по степени антигенного родства объединены в 18 серологических групп (приложение 1 настоящих Методических указаний). Лептоспироз у сельскохозяйственных животных других видов вызывают лептоспиры этих же серогрупп.

Заражение крупного и мелкого рогатого скота лептоспирами серогрупп Grippotyphosa и Hebdomadis часто массовое, происходит преимущественно при выпасании на территории природного очага от полевок и других видов мышевидных грызунов - основных хозяев лептоспир данных серогрупп. Заразившиеся сельскохозяйственные животные являются источником возбудителя инфекции.

Источником и основными хозяевами лептоспир серогрупп Tarassovi и Pomona (сероварианты manjakov и pomona) являются сельскохозяйственные животные и в первую очередь свиньи и крупный рогатый скот. Природные очаги лептоспир Tarassovi на территории Советского Союза не обнаружены. В природных очагах лептоспир Pomona паразитируют у полевых мышей, лептоспиры сероварианта mozdok, который вызывает у сельскохозяйственных животных только спорадические случаи инфекции. Лептоспирами Tarassovi и Pomona, в большинстве случаев, свиньи заражаются от свиней, крупный рогатый скот от крупного рогатого скота. Может наблюдаться межвидовое заражение.

Лептоспирами Icterohaemorrhagiae и Canicola сельскохозяйственные животные инфицируются от основных хозяев этих лептоспир: серых крыс и собак соответственно. Лептоспироз, вызванный этими возбудителями, протекает спорадически и не поражает больших групп животных.

3. Животные - лептоспироносители выделяют лептоспир во внешнюю среду с мочой и инфицируют воду, корма, пастбища, почву, подстилку и другие объекты внешней среды, через которые заражаются здоровые животные.

Наиболее благоприятная среда для сохранения лептоспир вне организма - вода открытых водоемов: невысыхающие лужи, пруды, болота, медленно текущие речки, влажная почва с реакцией, близкой к нейтральной.

Водный путь передачи возбудителя инфекции основной.

Заражение возможно при поедании трупов грызунов - лептоспироносителей или кормов, инфицированных мочой этих грызунов. Промысловые животные при клеточном их содержании заражаются в основном при поедании продуктов убоя больных лептоспирозом животных.

Лептоспиры проникают в организм животных и человека через поврежденные участки кожи (царапины, порезы, раны), слизистые оболочки ротовой полости, носа, глаз, половых путей.

4. Лептоспироз у сельскохозяйственных животных протекает остро, подостро, хронически и бессимптомно. Это наблюдается в любое время года, но у животных с пастбищным содержанием преимущественно в пастбищный период. Восприимчивы к лептоспирозу животные всех возрастов. Болезнь характеризуется кратковременной лихорадкой, иногда желтушным окрашиванием и некрозами слизистых и отдельных участков кожи, нарушением функции желудочно-кишечного тракта.

У свиней и подсвинков, взрослого крупного рогатого скота, лошадей, овец и коз лептоспироз протекает преимущественно бессимптомно. У не иммунных свиноматок, и реже у коров, лептоспироз сопровождается абортами в последний месяц беременности или рождением нежизнеспособного потомства. Аборты у свиноматок, в ранее благополучных хозяйствах, могут быть массовыми.

При вспышке лептоспироза острое течение инфекции с характерными клиническими признаками имеется у небольшого количества животных, а основная масса их переболевает бессимптомно.

Независимо от течения инфекции и вида животного на 5-7-й день после заражения в крови животного выявляются специфические антитела, а через 10-20 дней у ряда животных развивается лептоспироносительство, которое продолжается в течение нескольких месяцев и до 1-2 лет.

Поголовье лептоспироносителей на неблагополучной по лептоспирозу ферме среди крупного и мелкого рогатого скота составляет 1-5%, на отдельных фермах до 10-20%, среди свиней лептоспироносителями могут быть 30-80% животных и более.

Течение болезни не зависит от серогрупповой принадлежности возбудителя. Однако лептоспироз у крупного рогатого скота, вызванный возбудителями группы Hebdomadis, протекает чаще бессимптомно и только в отдельных случаях сопровождается лептоспироносительством.

5. Патологоанатомические изменения у павших от лептоспироза животных характеризуются геморрагическим диатезом и желтушным окрашиванием подкожной клетчатки, увеличением в объеме печени, дряблой ее консистенцией, на разрезе глинистого цвета, увеличением лимфатических узлов, сочных на разрезе и с кровоизлияниями. Мочевой пузырь переполнен мочой часто вишнево-красного цвета. Желтушное окрашивание тканей и кровавая моча не характерны для лептоспироза свиней.

При бессимптомном лептоспироносительстве видимые поражения локализуются преимущественно в почках и проявляются изменениями, характерными для острого или хронического паренхиматозного или интерстициального нефрита и дистрофии (мраморная окраска и изменение цвета поверхности, красные инфаркты, точечные серо-белые некротические очажки, кровоизлияния, сглаженность границы между мозговым и корковым слоями).

Диагноз на лептоспироз устанавливают бактериологическим, серологическим и гистологическим методами исследования с учетом эпизоотологических, клинических и патологоанатомических данных и проведением дифференциальной диагностики.

2. Бактериологическая диагностика лептоспироза

6. Бактериологическая диагностика основана на обнаружении лептоспир в исследуемом материале путем микроскопии или выделения культуры и складывается из следующих этапов:

а) взятие патологического материала;

б) микроскопия в темном поле микроскопа;

в) выделение культур лептоспир посевом в специальные среды или биологической пробой на лабораторных животных;

г) идентификация и дифференциация выделенных культур.

7. Порядок взятия материала для лабораторного анализа:

а) материалом для прижизненной диагностики служат кровь и моча, для посмертной - трупы мелких животных. От трупов крупных животных берут сердце, кусочки паренхиматозных органов, почку, транссудат из грудной и брюшной полостей, перикардиальную жидкость, мочевой пузырь с содержимым, спинномозговую жидкость.

Абортированный плод доставляют в лабораторию целиком или берут желудок с содержимым и паренхиматозные органы плода;

б) мочу собирают при естественном мочеиспускании в чистые пробирки, закрепленные на проволоке, или в банки, чашки Петри, кружки и т.д. Легче всего брать пробы после утреннего подъема животных, а у свиней в любое время дня после 1-2 часового лежания. У коров и свиноматок мочу можно брать катетером;

в) кровь в количестве 3-5мл берут для бактериологического исследования в период лихорадки на 1-7-й день болезни, для серологического исследования 5-10мл и не ранее чем через 5-7 дней после проявления клинических признаков болезни или через 60 дней после введения вакцины;

г) почку извлекают в невскрытой капсуле. Сердце, мочевой пузырь и желудок плода берут с содержимым, для чего накладывают лигатуры на соответствующие сосуды и сфинктеры. Каждый орган или кусочек органа завертывают отдельно в пергамент;

д) ликвор, транссудат, спинномозговую жидкость и другие жидкие субстраты насасывают стерильным шприцем или пипеткой в стерильные пробирки;

е) воду из водоисточника для обнаружения лептоспир берут в объеме 1,5-2л в стерильные колбы с ватно-марлевыми пробками;

ж) взятый материал помещают в ящик, опечатывают и направляют в лабораторию с нарочным;

з) патологический материал должен быть взят и исследован в течение 6 часов в летнее время и 10-12 часов - при условии хранения его в охлажденном состоянии;

и) микроскопия мочи должна быть закончена при температуре 30-40°С в течение 3 часов, 25-30°С - 4-5 часов, 20-25°С - 6-8 часов, 16-20°С - до 10-12 часов с момента взятия.

Вероятность обнаружения лептоспир в исследуемом материале в более поздние сроки не исключена, но значительно снижается;

к) ветеринарный специалист, направляя материал в лабораторию для исследования на лептоспироз, должен рассчитывать, чтобы взятие материала, доставка в лабораторию и проведение исследования укладывались в сроки выживания лептоспир в патологическом материале, в противном случае ответ будет заведомо отрицательным.

В сопроводительной к патологическому материалу должно быть указано время гибели животного или время взятия пробы при жизни.

8. Микроскопическое исследование.

а) для микроскопического исследования на лептоспироз необходимо:

1) биологический микроскоп (МБИ-3, МБИ-1, МБИ-11 и др.);

2) конденсор темного поля (ОИ-7, ОИ-13 и др.);

3) осветитель (ОИ-19, ОИ-21 и др.) с точечной лампой;

4) предметные стекла толщиной не более 0,8-1,1мм;

5) покровные стекла стандартные.

Стекла, используемые для микроскопии, должны быть бесцветными, прозрачными, чистыми, без царапин и бликов.

б) порядок микроскопии в темном поле. Осветитель соединяют с микроскопом соединительной планкой. Передвигая лампочку осветителя, фокусируют свет на центре плоского зеркала микроскопа. При этом четко должны быть видны завитки спирали. Верхнюю линзу конденсора устанавливают на уровне предметного столика. Центрируют конденсор с помощью регулировочных винтов по оптической оси микроскопа. На верхней линзе конденсора при правильной установке виден равномерно освещенный круг.

Препарат для микроскопических исследований готовят по принципу раздавленной капли. Небольшой объем исследуемого материала наносят пипеткой или бактериологической петлей на предметное стекло и накрывают покровным стеклом, избегая образования пузырьков воздуха. На одном предметном стекле готовят три раздавленные капли.

На верхнюю линзу конденсора наносят каплю дистиллированной воды и устанавливают препарат для микроскопии. Пространство между линзой конденсора и предметным стеклом должно быть заполнено тонким слоем воды, без пузырьков воздуха, что уменьшает рассеивание световых лучей. Фокус конденсора должен находиться в плоскости препарата. Конденсор при этом обычно вплотную прилегает к стеклу. Иногда в зависимости от толщины препарата его приходится опускать на 0,5-1мм.

Микроскопируют исследуемый материал при увеличении 40*7-10 и 20*1,5*7, а для более детального рассмотрения препарата-при увеличении 40*10-15 или 40*1,5*10.

9. Характеристика лептоспир:

а) лептоспиры при рассмотрении в темном поле микроскопа представляют собой спиралеподобные тонкие серебристые нити, - концы которых, оба или один, загнуты и булавовидно утолщены. Встречаются и бескрючковые формы лептоспир. Лептоспиры подвижны. В жидких средах обычными формами движения являются: вращательное, прямолинейное поступательное с одновременным вращением вокруг собственной оси и круговые. Одна и та же особь может совершать и вращательные и поступательные движения;

б) морфология и характер движения настолько типичны, что позволяют безошибочно распознавать лептоспир в патологическом материале. Кроме того, лептоспиры при микроскопии в отличие от других микроорганизмов никогда не бывают блестящими;

в) возможность безошибочной дифференциации лептоспир от микроорганизмов других видов по морфологическим признакам дает право при лептоспирозе устанавливать диагноз только на основании микроскопических исследований, без последующего выделения чистых культур и их идентификации.

10. Микроскопия мочи:

а) мочу микроскопируют в нативном виде или после центрифугирования. Прозрачную мочу, не содержащую кристаллов солей, хлопьев, спермиев и других посторонних частиц, центрифугируют при 10-15 тыс. об/мин в течение 30 минут, сливают надосадочную жидкость, осадок ресуспензируют в оставшейся капле мочи и микроскопируют.

Мочу, содержащую значительное количество посторонних частиц, очищают центрифугированием при 3 тыс. об/мин в течение 10 минут, затем сливают надосадочную жидкость и центрифугируют ее для осаждения лептоспир при 10-15 тыс. об/мин в течение 30 минут.

При массовом исследовании животных в хозяйстве готовят по одной, а при наличии немногих животных - не менее трех раздавленных капель из каждой пробы мочи. Просматривают 50 и более полей зрения в каждой капле;

б) лептоспир с активной подвижностью обнаруживают примерно в 50% положительных проб, в остальных случаях они неподвижны и довольно часто имеют измененную морфологию. Количество их также бывает различным. В моче примерно у 30% животных - лептоспироносителей содержатся по 1-2, реже по 5-7 и очень редко по 10-15 лептоспир в каждом поле зрения, в 30 - 35% случаев удается обнаружить 1-2 лептоспиры в 5-10 полях. В остальных случаях выявляют 1-2 лептоспиры в 20-50 и более полях зрения;

В кислой моче с рН 5,0-6,0 лептоспиры быстро утрачивают подвижность и погибают. Некоторые мертвые клетки сохраняют форму, типичную для лептоспир, но у них по длине тела бывает видна зернистость, довольно часто концевые крючки распрямлены.

11. Микроскопия крови:

Кровь, взятую от больного или подозреваемого в заболевании животного, смешивают с двойным количеством 1,5%-ного раствора лимоннокислого натрия, центрифугируют при 2-3 тыс. об/мин в течение 5 минут или отстаивают в течение часа, микроскопируют прозрачный надосадочный слой жидкости. Целесообразно осаждение лептоспир из надосадочной жидкости проводить центрифугированием при 10-15 тыс. об/мин в течение 30 минут;

12. Микроскопия суспензии из ткани органов:

а) при бессимптомном течении лептоспироза суспензию готовят из кусочков коркового слоя почки, а при остром течении - из почки и печени. У абортированного плода микроскопируют суспензию из всех органов;

б) кусочки исследуемого органа весом 2-3г. растирают в ступке с 5-7мл питательной среды, физиологического раствора или стерильной воды до получения гомогенной взвеси. Суспензию отстаивают в холодильнике 1-2 часа или центрифугируют при 3 тыс. об/мин в течение 10 минут и микроскопируют надосадочную жидкость;

в) транссудат из грудной и брюшной полостей, околосердечную жидкость, содержимое желудка плода и другие жидкие субстраты микроскопируют по той же методике, что и мочу;

г) из проб крови и суспензии каждого органа готовят не менее трех раздавленных капель и просматривают в каждой из них не менее 50 полей зрения.

13. Дифференциальная диагностика:

а) при микроскопической диагностике лептоспиры необходимо дифференцировать от нитей фибрина, обломков хвостовых частей спермиев, разрушенных эритроцитов, спиралло- и вибриоподобных микроорганизмов, интерспир у хряков и других микроорганизмов;

б) спермии постоянно содержатся в моче быков и хряков и часто в большом количестве. Обломки их хвостовых частей не имеют концевых крючков, неподвижны и вследствие преломления света кажутся блестящими;

в) нити фибрина постоянно обнаруживают в крови, транссудате и иногда в моче. Они не преломляют свет, но не имеют концевых крючков и не обладают подвижностью;

г) содержимое эритроцитов может выдавливаться через поры мембраны в виде тонких нитей. Такой эритроцит очень напоминает "паучок" из агглютинированных лептоспир. Свободный конец каждой нити под действием тока жидкости непрерывно извивается и колеблется. Часть нитей отрывается от эритроцитов и напоминает по форме и размерам лептоспир, но в отличие от последних они тоньше, не имеют крючков и не способны самостоятельно двигаться;

д) спирилла- и вибриоподобные микроорганизмы обнаруживают в 10-15% случаев в моче свиней и крупного рогатого скота и постоянно - в крови, спинномозговой жидкости, суспензии из органов, а также в тканях и жидкостях абортированных плодов. Эти микроорганизмы отличаются от лептоспир змееподобным движением и отсутствием концевых крючков;

е) интерспиры обитают в препуциальном мешке свиней. В моче, взятой при естественном мочеиспускании, их обнаруживают повсеместно в 50-80% случаев. В моче, взятой из мочевого пузыря, они не содержатся. Интерспиры подвижны. Оба или один конец микробной клетки перемещается судорожными, маятникообразными с широкой амплитудой движениями. После нескольких колебательных движений клетка некоторое время остается неподвижной, а затем снова можно наблюдать несколько очередных движений. Подвижность сохраняется не более 1-2 часов с момента получения мочи. Неподвижная интерспира имеет, так же как и лептоспира, один или два крючка и не преломляет свет, но в отличие от лептоспир у шее видны первичные завитки и тело клетки запоминает нить, состоящую из бусинок. Концы крючков заострены;

ж) другие микроорганизмы дифференцируют от лептоспир по форме и характеру движения, и все они, кроме того, преломляют свет и кажутся блестящими.

14. Выделение культур лептоспир:

а) выделение лептоспир из крови при жизни возможно впервые 5-7 дней болезни в период лихорадки. Для этой цели кровь из яремной или ушной вены вносят через стерильную иглу по 3-5 капель в 5-7 пробирок с питательной средой или высевают из пробы крови, присланной в лабораторию;

б) от трупа при диагностическом убое высевают пастеровской пипеткой кровь из сердца, ткани печени и почки, а от абортированного плода, кроме того, и из содержимого желудка. При убое клинически здоровых животных высевы делают из почки и мочевого пузыря. Из каждого органа засевают 3-5 пробирок с питательной средой;

в) для выделения культур из почки ее освобождают от капсулы, поверхность прижигают шпателем или горящим спиртовым тампоном, пипетку вводят параллельно поверхности в корковый слой. Высев делают у крупного рогатого скота из 2-3 долей почки, у свиней из нескольких участков почки;

г) высевы из других органов делают по общепринятой методике.

Мочу, ликвор, околосердечный, брюшной транссудат и другие жидкие биосубстракты засевают по 1-3 капли в 3-5 пробирок с питательной средой;

д) посевы культивируют при температуре 28-30°С в течение трех месяцев. Лептоспиры, размножаясь в питательной среде, не изменяют ее внешнего вида. Поэтому для выявления роста лептоспир через 3, 5, 7, 10 и далее каждые 5 дней культивирования из всех пробирок микроскопируют капли, которые наносят на предметное стекло бактериологической петлей. Большинство культур вырастает через 7-20 дней. Иногда лептоспиры обнаруживают в среде на 3-5-й день, через 1-2 месяца и очень редко через 2-3 месяца культивирования.

Содержимое каждой пробирки, в которой обнаружены лептоспиры, пересевают в 3-5 пробирок со свежей питательной средой. Пробирки с обильным ростом посторонней микрофлоры уничтожают.

15. Порядок сохранения культур:

а) пересевы культур лептоспир производят пастеровскими пипетками. В пробирку с 5-10мл питательной среды вносят 0,5-1,0 мл культуры. Максимальное накопление лептоспир наблюдается через 4-7 дней культивирования при температуре 28-30°С;

б) рост и чистоту культуры лептоспир в жидких питательных средах контролируют микроскопически в темном поле микроскопа и макроскопически - просмотром пробирок с культурами в луче света от осветителя. При этом после встряхивания в питательной среде четко просматриваются муаровые волны, образуемые выросшей культурой.

Культуру лептоспир пересевают через каждые 10-15 дней не менее чем в 3-4 пробирки;

в) штаммы лептоспир, постоянно поддерживаемые в лаборатории, можно хранить в пробирках под вазелиновым маслом, в запаянных ампулах, в морозильной камере при -70-80°С или при температуре жидкого азота (-190°С). Лептоспиры консервируют любым из этих методов после выращивания в сывороточной среде до максимального накопления.

В пробирку на культуру наслаивают 1-1,5 мл стерильного вазелинового масла или культуру расфасовывают в стерильные 1-5 мл ампулы из нейтрального стекла и запаивают.

Хранят пробирки и ампулы в темном месте при комнатной температуре. В таких условиях лептоспиры можно хранить без пересевов в течение трех месяцев;

г) для хранения в замороженном состоянии культуры расфасовывают в ампулы, запаивают, охлаждают до 0-4°С и помещают в сосуды Дьюара, заполненные азотом, или морозильную камеру.

В жидком азоте лептоспиры можно хранить без пересевов в течение года, при этом они заметно не изменяют своих биологических свойств;

16. Очистка загрязненных культур лептоспир.

а) культуры лептоспир, загрязненные микрофлорой, очищают биологическим методом, фильтрацией через бактерийные фильтры или пересевом на плотные питательные среды;

б) для очистки биологическим методом загрязненную культуру вводят внутрибрюшинно морским свинкам в дозе 1-2мл, крольчонку - 1-2мл, хомяку или мыши - 0,5мл. Через 30-60 минут кровь из сердца зараженного животного высевают в пробирки с питательной средой;

в) лептоспиры проходят через асбестовые фильтровальные пластины марки СФ и свечи Шимберляна Л-5. Для очистки методом фильтрации загрязненную культуру фильтруют через простерилизованный фильтр. Фильтрат рассеивают в 5-10 пробирок с питательной средой. В высевах из фильтрата получают чистую культуру лептоспир.

17. Постановка биологической пробы:

а) восприимчивы к лептоспирозу при экспериментальном заражении золотистые хомяки, крольчата, морские свинки, крапчатые суслики, щенки собак, котята, белые и серые мыши. Для повседневной практической работы используют золотистых хомяков 20-30-дневного возраста и крольчат-сосунов в возрасте 10-20 дней. Молодые свинки (3-5-недельного возраста) весом 150-200г. наиболее чувствительны к L. icterohaemorrhagiae, в меньшей степени - к L. pomona и мало чувствительны к лептоспирам других серологических групп;

б) лабораторных животных заражают для выделения культур лептоспир из патологического материала и объектов внешней среды, очистки культур лептоспир от посторонней микрофлоры, определения вирулентности выделенных культур и дифференциации от сапрофитов;

в)для выделения культур лептоспир животных заражают кровью, мочой, суспензией из паренхиматозных органов животных (абортированного плода) или спермой.

Исследуемый материал вводят подкожно или внутрибрюшинно хомякам от 0,3-0,5 до 1мл, крольчатам - 2-3мл;

г) на каждую пробу исследуемого материала необходимо брать по два зверька: одного из них убивают на 4-5-й, другого, если он не погибает, на 14-16-й день после заражения. Кровь зверька, убитого на 14-16-й день после заражения, исследуют по реакции микроагглютинации, начиная с разведения 1:10 с лептоспирами 13 серологических групп. Положительная РМА свидетельствует о наличии лептоспир в исследуемом материале;

д) высевы от убитых и павших зверьков делают из сердца, печени и почки в 2-3 пробирки из каждого органа. Вторую почку, кусочки печени, транссудат из грудной и брюшной полостей, околосердечную жидкость и содержимое мочевого пузыря микроскопируют.

е) Культуры лептоспир чаще удается выделить из органов зверька в период проявления клинических признаков болезни, проявляющихся отказом от корма, вялостью, дрожью, взъерошенностью шерсти, конъюнктивитом, желтушностью видимых слизистых оболочек и т.д.;

ж) у крольчат и морских свинок проводят после заражения термометрию. У крольчат нормальной температурой считается 38,5-39,5°С, у свинок - 38-39,5°С. В период лихорадки, кровь берут из уха или сердца шприцем для микроскопии и посева;

з) патогенность и вирулентность выделенных культур лептоспир проверяют на золотистых хомяках или крольчатах. Патогенные лептоспиры способны размножаться в организме животного, вызывать клинические проявления болезни, характерные патологоанатомические изменения и гибель животного. Лептоспиры-сапрофиты такими свойствами не обладают. Заражение животных проводят внутрибрюшинно 5-7-дневной культурой, содержащей 70-100 лептоспир в поле зрения микроскопа. Культуры лептоспир, убивающие золотистых хомяков на 5-12-й день дозой менее 0,1мл, считают высоковирулентными, 0,2-0,4мл - средней вирулентности и 0,5-1мл-слабовирулентными;

и) в качестве биологической модели для обнаружения лептоспир могут быть использованы взрослые кролики и морские свинки. Кровь животных исследуют по РМА на наличие специфических антител. Животных, в крови которых не обнаружены специфические антитела, заражают исследуемым материалом.

Кровь зараженных животных исследуют три раза, через каждые семь дней по реакции микроагглютинации начиная с разведения 1:10 с лептоспирами 13 серологических групп. Обнаружение в крови зараженных животных специфических антител свидетельствует о наличии лептоспир в исследуемом материале и позволяет ориентировочно судить о их серогрупповой принадлежности.

3. Бактериологическое исследование воды

18. Вода является основным фактором в передаче возбудителя лептоспироза.

Лептоспир обнаруживают в воде биологической пробой на крольчатах, свинках, хомяках, крапчатых сусликах, взрослых кроликах, используя одну из следующих методик.

19. Пробы воды объемом 1-2л берут в стерильную посуду, подогревают до 30°С и выливают в эмалированный кювет, - помещают в него на один час двух подопытных животных. Кожа брюшка или задние ноги, которых скарифицированы, так чтобы скарифицированная поверхность была погружена в воду. Начиная с четвертого дня у крупных зверьков (крольчата, морские свинки) берут кровь из сердца с целью выделения гемокультур, исследуют микроскопически брюшной экссудат. Одного из мелких зверьков убивают. На 14-20-й день всех выживших животных также убивают. Патологический материал исследуют на наличие лептоспир. Кровь исследуют на РМА.

20. Пробу воды (до 500мл) центрифугируют при 10-15 тыс. об/мин в течение 30-ти минут, сливают надосадочную жидкость, а осадки из всех центрифужных стаканов суспензируют в стерильной-питательной среде для лептоспир или физиологическом растворе. Суспензию вводят внутрибрюшинно или подкожно хомякам по 0,5-1мл, крольчатам и морским свинкам по 1-2 мл. В дальнейшем исследуют, как указано в пункте 7 настоящих Методических указаний.

21. Полученный после центрифугирования осадок подкожно вводят в дозе 2-3мл взрослым кроликам, не имеющим в крови лептоспирозных антител.

Через 7-14 и 20 дней кровь кролика исследуют по РМА с лептоспирами 13 серологических групп. Обнаружение специфических антител в титре 1:10 и выше свидетельствует о наличии лептоспир в исследуемой пробе воды.

4. Импрегнация гистологических срезов из органов
серебром по Левадити

22. Материалом для гистологического исследования служат кусочки коркового слоя почек и печени толщиной не более 1см, консервированные 10%-ным раствором формалина.

Лептоспиры удается обнаружить с наибольшим постоянством в гистологических срезах импрегнированных серебром по Левадити. Методы Крантца, Полагута и Майера менее эффективны.

23. Несколько кусочков органов не толще 1см, лучше 2-3мм, фиксируют в 10%-ном водном растворе нейтрального формалина 24-48 часов. После фиксации кусочки переносят в 96 спирт на 24 часа. Промывают в дистиллированной воде до тех пор, пока кусочки не осядут на дно бюкса (не менее 2-3 часов), воду меняют три раза.

24. Помещают кусочки в 1-3%-ный раствор азотнокислого серебра на 3-6 дней. Процесс серебрения ведут при температуре 37°С. Раствор азотнокислого серебра готовят на свежей дистиллированной воде из расчета 15мл раствора на один кусочек.

25. Прополаскивают в дистиллированной воде в течение 2-5 минут. После промывки кусочки переносят в небольшую порцию редуцирующей смеси в отдельной чашечке на 2 минуты (раствор быстро темнеет) и затем помещают их в приготовленный перед употреблением основной редуцирующий раствор следующего состава: пирогалловая кислота - 4г, дистиллированная вода - 100мл, формалин чистый - 5мл.

Раствор готовят из расчета 20-25мл на один кусочек ткани. Восстановление обязательно проводят в банке из темного стекла.

26. Кусочки выдерживают в редуцирующей смеси 24-48 часов при комнатной температуре в темном месте или в банке из темного стекла.

Время выдержки контролируют приготовлением единичных срезов через каждые 12-16 часов во избежание передержания, так как срезы могут стать черными. Промывают в дистиллированной воде 1-2 часа.

27. Обрабатывают препараты последовательно спиртами: в 96 спирт (спирт 1) на сутки; в 96 спирт (спирт 2) на сутки; в 96 спирт (спирт 3) - на сутки; спирт-метил (спирты этиловый и метилсалициловый поровну) - до опускания кусочков на дно бюкса, а затем в метилсалициловый - до утра.

28. После этого перекладывают в кашу-парафин (ксилол и парафин поровну) на 30 минут при 57; парафин 1 - на 60 минут при 57°С; парафин 2 - на 60 минут при 57°С.

Из быстро остуженного парафина вырезают блок с кусочком органа и наклеивают на деревянный кубик. Приготавливают тонкие срезы на санном микротоме и наклеивают на предметное стекло, депарафинируют в трех бюксах с ксилолом по 10-15 минут в каждом и заключают под покровное стекло в канадский бальзам, подсушивают и просматривают под микроскопом со светлопольным конденсором при увеличении 90

В случае неудовлетворительных результатов импрегнации лептоспир готовят препараты из других одновременно приготовленных блоков. Препараты необходимо хранить в темноте.

29. Микрокартина: лептоспиры черные, окружающая ткань буровато-желтая. Лептоспиры располагаются на поверхности эпителия и в просветах мочевых канальцев почек, несколько реже - в цитоплазме эпителия, преимущественно группами. После импрегнации серебром типичные лептоспиры имеют S-образную с 1-2 изгибами или змеевидную форму с грубыми, толстыми завитками, которые в отдельных случаях слабо заметны. Иногда в просвете и на поверхности эпителия мочевых канальцев встречаются аргирофильные гранулы (окрашены в цвет лептоспир), которые при отсутствии типичных форм нельзя принимать за лептоспир.

5. Серологическая диагностика лептоспироза

30. Серологическая диагностика лептоспироза основана на обнаружении специфических антител в крови животных, реакцией микроагглютинации (РМА) или реакцией микроагглютинации (РА).

31. Сыворотку крови животных исследуют на лептоспироз по РМА или РА для выяснения благополучия хозяйства по этому заболеванию и установления диагноза на лептоспироз у отдельных животных.

В последнем случае проводят 2-3 кратное исследование. Кровь берут для исследования на 5-7-й день болезни и повторно через 7-10 дней.

32. Порядок постановки и учета реакции микроагглютинации (РМА).

а) для постановки реакции микроагглютинации необходимы:

1) исследуемая сыворотка крови животных;

2) антигены - культуры диагностических штаммов лептоспир;

3) электролит - физиологический раствор;

4) микроскоп, конденсор темного поля и осветитель те же, что для микроскопической диагностики;

5) агглютинационные пластинки или пробирки Флоринского;

6) 40-100-гнездные штативы;

7) бактериологические пробирки;

8) градуированные пипетки на 1, 2, 5 и 10мл;

9) аппарат Флоринского;

10) предметные стекла.

б) исследуемая сыворотка. Для исследования пригодна сыворотка свежая, замороженная, высушенная на фильтровальной бумаге, консервированная фенолом или борной кислотой. Консервируют отстоявшуюся сыворотку, слитую в сухие стерильные пробирки.

Добавляют 5%-ный раствор фенола при постоянном помешивании 0,05мл (1 капля) на каждый миллилитр сыворотки.

Борную кислоту вносят в сыворотку до получения насыщенного раствора и образования на дне пробирки небольшого осадка кристаллов. Кристаллы кислоты не должны попадать в пипетку во время постановки реакции.

Высушивают сыворотку на квадратах (5*5 см) белой фильтровальной бумаги по 3-5 капель (0,05мл каждая) при комнатной температуре или в термостате при температуре 37°С. Консервированные пробы сыворотки пригодны для исследования в течение месяца. Гемолизированные, загнившие, плесневелые и проросшие сыворотки не исследуют;

в) антигены. В качестве антигенов в РМА используют живые культуры лептоспир различных серологических групп. В лаборатории ставят реакцию с лептоспирами 13 серологических групп: Icterohaemorrhagiae, Javanica, Canicola, Pyrogenes, Cynoptery, Autumnalis, Pomona, Grippotyphosa, Hebdomadis, Tarassovi, Bataviae, Australis, Ballum.

Сыворотку крови диких животных исследуют с лептоспирами 13-15 серогрупп.

Пригодность культуры для использования в реакции оценивают путем просмотра пробирок в проходящем свете и микроскопией.

При достаточном накоплении лептоспир после встряхивания пробирки с культурой в проходящем свете в среде хорошо заметны муаровые волны, а в спокойном состоянии легкая опалесценция. Наличие осадка, пленки, помутнения среды свидетельствует о прорастании культуры посторонней микрофлорой, полная прозрачность среды - об отсутствии лептоспир.

В реакции используют чистые культуры лептоспир в возрасте 5-15 дней без признаков агглютинации и лизиса (четкообразные, неподвижные клетки) с накоплением 70-100 микробных клеток в поле зрения микроскопа при увеличении 20*10*1,5 или 40*7-10. Культуры, содержащие 150-200 и более лептоспир в поле зрения микроскопа, разводят перед постановкой реакции питательной средой или физиологическим раствором до указанной концентрации.

Каждое разведение сыворотки разливают в отдельный ряд, состоящий из 5-13 лунок (пробирок) в зависимости от количества антигенов, используемых в реакции. Каждую культуру-антиген вносят по 0,1мл в три лунки с разными разведениями сыворотки. После добавления антигенов пластины встряхивают и выдерживают в термостате при температуре 30°С в течение часа.

Контролем служит смесь культуры лептоспир с физиологическим раствором по 0,1мл. Лептоспиры в контроле должны оставаться подвижными, не иметь признаков лизиса и агглютинации.

г) реакцию учитывают путем микроскопии капель из каждой лунки в темном поле микроскопа при увеличении 20*10 или 20*7*1,5. Капли из лунок выносят на предметное стекло бактериологической петлей от большего разведения к меньшему и просматривают их без покровного стекла.

Капли можно наносить двумя способами:

1) бактериологической петлей диаметром 3мм наносят на стекло сразу до 30 капель и затем просматривают их под микроскопом;

2) бактериологической петлей диаметром 1мм наносят на предметное стекло в освещенный центр поля зрения одну каплю и просматривают ее, передвигают столик на 2-3мм и рядом с первой наносят и учитывают вторую каплю. В этом случае на одном предметном стекле учитывают 60-80 капель.

После каждого антигена петлю прокаливают и охлаждают.

д) Результаты реакции оценивают в крестах по четырехбалльной системе:

+ + + + агглютинированы 100% лептоспир;

+ + + - агглютинированы 75% лептоспир;

+ + - - агглютинированы 50% лептоспир;

+ - - - агглютинированы 25% лептоспир;

- (знак минус) агглютинация отсутствует. Агглютинация проявляется в склеивании лептоспир и образовании паучков. Паучок включает от 3-5 до нескольких десятков и даже сотен лептоспир. Свободные концы лептоспир сохраняют подвижность.

В начальных разведениях сыворотки может наблюдаться лизис лептоспир, проявляющийся в набухании и обездвиживании, появлении зернистости и полного распада микробных клеток.

е) положительной считают реакцию, оцененную не менее чем на два креста, при отсутствии агглютинации в контроле.

При повторном исследовании сыворотки крови реакцию ставят в тех же разведениях.

33. Оценка показаний РМА и РА:

а) животных с титром сыворотки в РМА 1:100 или реагирующих по РА на 1-2 креста, кроме лошадей и крупного рогатого скота, реагирующих с лептоспирами группы Hebdomadis, считают подозреваемыми в заражении.

Крупный рогатый скот, реагирующий с лептоспирами группы Hebdomadis, и лошадей, реагирующих с лептоспирами любой серологической группы, считают подозреваемыми в заражении при титре антител в РМА 1:500 или реагирующих в РА на 1-2 креста с неразведенной сывороткой.

Кровь от животных, подозреваемых в заражении, и от животных, не реагировавших при первом исследовании, повторно проверяют через 7-10 дней;

б) выявление антител у животных, не реагировавших при первом исследовании, или нарастание титра у реагировавших в РМА в пять и более раз, или положительная РА на 3-4 креста свидетельствуют об активном инфекционном процессе у обследуемых животных;

в) животных (кроме лошадей и реагирующего с лептоспирами группы Hebdomadis крупного рогатого скота) с титром сыворотки в РМА 1:500 и более или в РА на 3-4 креста и крупный рогатый скот, реагирующий с лептоспирами группы Hebdomadis и лошадей, реагирующих с лептоспирами любой серогруппы при титре в РМА 1:2500 и более или в РА на 3-4 креста, рассматривают как возможных лептоспироносителей.

г) возбудителями лептоспироза при серологической диагностике считают лептоспир той серологической группы, к которой обнаружены антитела в наиболее высоком титре.

Необходимо учитывать, что в сыворотке крови свиней, крупного рогатого и мелкого рогатого скота и лошадей при исследовании по РМА обнаруживают в 5-15% случаев (из числа положительно реагирующих) антитела в наиболее высоком титре к лептоспирам Australis, Autumnalis, Ballum, Pyrogenes, Cynoptery, Bataviae, которые не были выделены ни в одном случае от сельскохозяйственных животных.

Такие реакции следует рассматривать как межгрупповые, являющиеся следствием заражения животных лептоспирами Pomona, Tarassovi и другими, обычно выделяемыми от сельскохозяйственных животных.

Лептоспиры Australis, Bataviae, Autumnalis, Ballum, Pyrogenes, Cynoptery, Kazachstanica могут быть признаны возбудителями лептоспироза у сельскохозяйственных животных только после выделения этих лептоспир в чистой культуре или подтверждении их роли реакцией иммуноабсорбции.

34. Методика постановки реакции иммуноабсорбции при исследовании проб сыворотки:

а) в реакции иммуноабсорбции изучают пробы сыворотки животных, агглютинирующие лептоспиры нескольких серологических групп в равно высоких титрах или имеющие наиболее высокий титр - по отношению к лептоспирам, ранее не известным в качестве возбудителя лептоспироза у сельскохозяйственных животных;

б) для проведения абсорбции выращивают в 0,2 - 0,5 - литровых флаконах все штаммы лептоспир, с которыми данная проба сыворотки дала реакцию агглютинации. К 5-7-суточным культурам добавляют 0,3% формалина и выдерживают 10-12 часов. Затем лептоспиры осаждают центрифугированием при 10 000 об/мин в течение 30 минут. Сливают надосадочную жидкость, а осадок суспензируют в объеме 0,9мл среды или физиологического раствора, 0,1мл исследуемой сыворотки смешивают с 0,9мл концентрированного антигена и выдерживают в течение 48 часов при температуре 1-5°С. Абсорбированную сыворотку проверяют в РМА на наличие остаточных антител к штамму-абсорбенту, а затем исследуют с лептоспирами групп, с которыми реагировала сыворотка до абсорбции;

в) в процессе абсорбции лептоспиры, являющиеся возбудителем инфекции у данной особи, извлекают из сыворотки антитела к лептоспирам всех других серологических групп, в то время как антитела к штамму-возбудителю болезни не абсорбируются из сыворотки гетерологичными типами лептоспир.

Для сокращения объема работы сыворотку можно вначале абсорбировать лептоспирами, являющимися наиболее частыми возбудителями болезни у животных данного вида.

Приложение N 1
к Приказу Министерства
здравоохранения и социальной защиты
Приднестровской Молдавской Республики
от 8 февраля 2012 года N 82

"Приложение N 1 к Методическим
указаниям по диагностике
лептоспироза животных на территории
Приднестровской Молдавской Республики"

       Серологиесике варианты по степени антигенного родства

--------------------------------------------------------------------------
| Серологическая |      Серологический       |       Типовой штамм       |
|     группа     |        вариант            |                           |
|----------------|---------------------------|---------------------------|
|  Icterohae-    |   icterohaemorrhagiae     |    RGA M-20 Mankarso Naam |
|   morrhagiae   |  copenhageni mankarso     | wogolo Grand River Sarmin |
|                | naa'm   mwogolo dakota    |   Birkin Smith Ndambari   |
|                | sarmin  birkini smithi    | dahambukuje PV-1 GZ-390-U |
|                | ndambari ndahambukuje     |                           |
|                | budapest weaveri          |                           |
|----------------|---------------------------|---------------------------|
|  Javanica      |  javanica poi sorex-      | Veldrat Batavia 46 Poi    |
|                |  jalna coxi sofia         | Sorex Jalna Cox Sofia 874 |
|----------------|---------------------------|---------------------------|
|  Celledoni     |  celledoni whitcombi      | Celledoni Whitcombi       |
|----------------|---------------------------|---------------------------|
|  Canicola      |  canicola bafani          | Hond Utrecht IV Bafani    |
|                |  kamituga jonsis          | Kamituga Jones Sumner     |
|                |  sumneri broomi bindjei   | atane Bindjei Vleermuise  |
|                |  schnueffneri             | 90-C Benjamin H-6         |
|                |  benjamin malaya          |                           |
|----------------|---------------------------|---------------------------|
|  Ballum        |  ballum  castellonis      | MUS-127 Castellon-3       |
|                |      arboreae             |      Arboreae             |
|----------------|---------------------------|---------------------------|
|  Pyrogenes     |  pyrogenes  Zanoni        | Salinem Zanoni LSU-1551   |
|                |  myocastoris abramis      | Abraham Biggs Hamptom     |
|                | biggis hamptoni alexi     | HS-616 Robinson LT-398    |
|                | robinsoni rnanilae        |                           |
|----------------|---------------------------|---------------------------|
|  Cynopteri     |  cynopteri  canalzoniae   | 3522-C Cz-188k Butembo    |
|                |        butembo            |                           |
|----------------|---------------------------|---------------------------|
|  Autumnalis    |  autumnalis  rachmati     | Akiyama A Rachmat Fort    |
|                | fortbragg   sumatrana     | Bragg Sapulette           |
|                | bulgarica bangkinang      | Nikolaevo Bangkinang-1    |
|                | erinaceiauriti mooris     | Erinaceus auritus 670     |
|                | sentot louisiana          | Moores Sentot LSU-1945    |
|                | Orleans  djasiman         | LSU-2580 Djasiman Gurung  |
|                |    gurungi                |                           |
|----------------|---------------------------|---------------------------|
|  Australis     | australis lora muenchen   | Ballico Lora Munchen C-90 |
|                |  jalna  bratislava        | Jalna Jez Bratislava      |
|                | fugis bangkok peruviana   | Fudge Bankok D-92 Lt-941  |
|                |    pina nicaragua         | Lt-932 Lt-990             |
|----------------|---------------------------|---------------------------|
|  Pomona        | pomona kennewieni         | Pomona Lt-1026            |
|                | monjakov mozdok tropika   | Monjakov 5621             |
|                | proechimys                | CZ-299U Lt-796            |
+----------------+-------------------------+-----------------------------|
| Grippotypho-sa | grippotyphosa  valbuzzi   | Moskva-V  Valbuzzi        |
|----------------|---------------------------|---------------------------|
|  Hebdomadis    | hebdomadis  nona          | Nebdomadis Nona Kambale   |
|                | kambale  kremastos        | Kremastos Worsfold        |
|                | worsfoldi jules           | Jules CZ-285-B HS-622     |
|                | maru borincana kabura     | Kabura Sari               |
|                | mini                      |                           |
|----------------|---------------------------|---------------------------|
|  Hebdomadis    | szwajizak georgia         | Szwajizak Lt-117          |
|                | perameles wolffi hardjo   | Bandicoot-343 3705        |
|                | recreo medanensis         | Hardjoprajitno Lt-957     |
|                | trinidad seiroe balcanica | Hond-HC Lt-1098 M-84 1627 |
|                | polonica nero haemolytica | Burgas 493-Poland Qamsuli |
|                |  ricardi                  | March Richardson          |
|----------------|---------------------------|---------------------------|
|  Bataviae      | bataviae                  | Van Tienem Paidjan        |
|                | paidjan djatzi kobbe      | HS-26 CZ-320-K Lt-818     |
|                | balboa claytoni           | Lt-996                    |
|                | brasiliensis              |                           |
|----------------|---------------------------|---------------------------|
|  Tarassovi     | tarassovi  bakeri         | Perepelicin Lt-79 Lt-81   |
|                | atlantae  guidae          | RP-29 Kisuba Bravo        |
|                | kisuba  bravo             | LSU-1013 Lt-924 Lt-955    |
|                | tchafalaya  chagres       | Lt-839                    |
|                | rama   gatuni             |                           |
|----------------|---------------------------|---------------------------|
|   Panama       | panama                    | CZ-214-K                  |
|----------------|---------------------------|---------------------------|
|  Sherman       | shermani                  | LT-821                    |
|----------------|---------------------------|---------------------------|
|  Semaranga     | semaranga patoc sao-paulo | Veldrat Semarang-173      |
|                |                           | Patoc  I  Sao  Paulo      |
|----------------|---------------------------|---------------------------|
|  Andamana      |     andamana              |       CH-11               |
--------------------------------------------------------------------------